◎ 潘曉梅
(白銀市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,甘肅 白銀 730900)
凝集素是指非免疫來源的糖結(jié)合蛋白,其具有凝集細(xì)胞和沉淀糖復(fù)合物以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。植物凝集素作為微生物與植物的共生介質(zhì),可防止植物病原菌對(duì)植物造成危害。隨著研究的深入和發(fā)展,凝集素的藥物價(jià)值也體現(xiàn)的越來越明顯。同時(shí),凝集素在抗動(dòng)植物病毒、防御真菌、營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存和生物固氮等方面也有著重要的作用。近年來,隨著對(duì)凝集素研究的展開,人們已經(jīng)越來越認(rèn)識(shí)到凝集素的重要性,其在免疫學(xué)、腫瘤、生殖生理和細(xì)胞生物學(xué)等許多方面都得到應(yīng)用,在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)上呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。
大蔥具有大蒜素、果膠等多種物質(zhì),具有抗菌、抗病毒、防癌及抗癌等生理作用,而對(duì)大蔥中植物凝集素的研究尚未開展。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大蔥中的凝集素進(jìn)行分離純化和鑒定,為大蔥的生理活性研究提供理論基礎(chǔ)[1]。
MJ-176NR 高速組織搗碎機(jī)(松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)、KDC-160H 冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)、600型恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)、DEAE-52 離子交換柱(2.6 cm×40 cm,上海滬西分析儀器廠)、Biologic DuoFlow 中高壓柱層析系統(tǒng)(美國伯樂公司)、DYCP-12c 電泳儀(北京六一儀器廠)、Mini-PROTEAN 3 垂直平板電泳槽(美國伯樂公司)、100 μL 微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)以及HI 2210 pH METER pH 計(jì)(意大利哈納儀器公司)。
大蔥(產(chǎn)源地山東)、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、硫酸銨、鹽酸、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G250、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、氨水,冰醋酸、甲醇、甘油、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘氨酸、DEAE 纖維素(52)、十二烷基硫酸鈉(SDS,≥99.0%)及三羥甲基氨基甲烷(Tris,≥99.9%),所用試劑均為分析純。
生理鹽水;飽和硫酸銨溶液(pH7.0);25 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(Tris buffer saline,TBS);磷酸緩沖鹽溶液(PBS,0.017 5 mol·L-1,pH6.7)1 000 mL;子交換層析所用試劑:磷酸緩沖液(pH7.4,0.15 mol·L-1),0.05 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液;SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳試劑凝膠貯液;0.05 mol·L-1pH8.0 Tris-HCl緩沖液;分離膠緩沖液;電極緩沖液(3 g Tris、14.4 g甘氨酸、1 g SDS、ddH2O 定容至1 000 mL);樣品緩沖液;過硫酸銨(AP)溶液;染色液;洗脫液;標(biāo)準(zhǔn)蛋白(次高分子量);濃縮膠緩沖液;固定液;阿氏液(Alsevers,提前配制[2])。
將透析袋剪成15 cm 長度,先用50%乙醇浸泡20 min,去除表面的油脂類物質(zhì);再用0.01 mo1·L-1Na2CO3和0.01 mo1·L-1EDTA 煮沸30 min,去除表面的重金屬、鹽等雜質(zhì)。處理好的透析袋浸入蒸餾水中,保存在冰箱中備用。
活化纖維素一般按樣品的蛋白質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算,是蛋白質(zhì)量的10 ~15 倍。取DEAE 纖維素1.5 g,溶解于0.1 mol·L-1NaOH 溶液中,浸泡過夜,盛裝于錐形瓶中;布氏漏斗上減壓過濾,蒸餾水重復(fù)清洗至pH8.0左右,抽干;用0.1 mol·L-1HCl 溶液浸泡30 min,用蒸餾水清洗至pH6.0 左右,抽干;BS(0.017 5 mol·L-1,pH6.7)浸泡3 h;傾去微細(xì)不沉降的懸浮顆粒,加入PBS(0.017 5 mol·L-1,pH6.7)使容積為沉淀體積的1.5 倍。
1.5.1 粗提取液制備
大蔥洗凈粉碎勻漿,取上清液,加入硫酸銨近約60%飽和度,4 ℃冷藏靜置過夜,5 000 r·min-1離心20 min 棄去上清液,取沉淀得到大蔥蛋白粗提取產(chǎn)物。將沉淀用Na2HPO4-Na2HPO4(pH7.4)緩沖液溶解后,離心去沉淀取上清液,用Na2HPO4-Na2HPO4(pH7.4)緩沖液透析除去硫酸銨,奈氏試劑檢驗(yàn)完全沒有硫酸銨時(shí)為透析終點(diǎn)。再用聚乙二醇進(jìn)行樣品濃縮至體積≤5 mL,準(zhǔn)備上樣層析。
1.5.2 DEAE-離子交換層析
取濃縮液上樣DEAE-52 作為固定相(1.5 cm×30 cm),活化后的層析柱用0.05 mol·L-1Tris-HCl(pH8.0)緩沖液平衡,用0 ~800 mmol·L-1Tris-HCl溶液進(jìn)行離子強(qiáng)度線性梯度洗脫,洗脫處理溫度25 ℃,流速為1 mL·min-1,用1.5 mL 離心管收集不同時(shí)間段內(nèi)流出的洗脫液,得到層析分離液,每管洗脫液對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào),洗脫完成后-20 ℃保存。
1.5.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
清洗玻璃板,制備模具;按表1 配方分別配制分離膠和濃縮膠;在濃縮膠聚合完成后(30 min),拔梳子,沖洗加樣孔,把含膠的模具放入電泳槽中,加入電極液至沒過加樣孔;上樣量根據(jù)蛋白濃度確定,為20 μg總蛋白;電壓恒定在100 ~150 V;待溴酚藍(lán)快走到分離膠的底部,準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)移;將膠置于固定液中浸泡30 min 后將分離膠浸入染色液中染色30 min;取出分離膠,先用蒸餾水漂洗一次,浸入脫染液中脫染,室溫浸泡凝膠或37 ℃加熱使其脫色,更換脫色液,直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止;以各標(biāo)準(zhǔn)樣品遷移率做橫坐標(biāo),分子量做縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
表1 濃縮膠和分離膠的配方表
自實(shí)驗(yàn)用白兔耳緣靜脈采集血液,血樣采集后立即與等體積的阿氏液混合,并用TBS 溶液(0.025 mol·L-1,含0.15 mol·L-1NaCl,pH7.5)潤洗4 ~5 次,第1 次2 000 r·min-1離心3 min,第2 ~4 次3 000 r·min-1離心2 min,第5 次以3 000 r·min-1離心3 min,每次離心后小心棄去上清液,潤洗后用TBS 配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的兔血紅細(xì)胞懸液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
在96 孔“V”型微量血凝板中進(jìn)行。先在每孔中加入25μL 的生理鹽水,再向每孔中加入層析后的蛋白洗脫液25μL,并在一個(gè)孔中加入25μL 的生理鹽水最為空白對(duì)照,將血球緩沖液依次加入每孔內(nèi)。輕微振蕩搖勻后靜置15 min 進(jìn)行觀察[3-5]。與生理鹽水的空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照,若有明顯差異的即為有凝集活性。同樣可觀察凝集的紅細(xì)胞邊緣的齊整程度,若有參差即為有凝集活性;若邊緣平整,則為紅細(xì)胞受重力作用自動(dòng)沉淀。
由圖1 可見,大蔥提取液經(jīng)過層析,紫外分析得到4 個(gè)特征吸收峰,分別為5、15、28 和41 號(hào)收集管,即分離得到4 組活性物質(zhì)。
圖1 層析后蛋白質(zhì)在280 nm 處吸光值折線圖
經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,測(cè)出該凝集素在凝膠中有色帶,由圖2 可計(jì)算出蛋白質(zhì)的遷移率為49.2%,從標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量曲線求的凝集素的表觀分子質(zhì)量為41 kDa。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)照見圖3,SDS 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。
圖2 SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠圖
在96 孔板中分別加入具有特征吸收的層析收集液,生理鹽水為空白對(duì)照組,同時(shí)用血漿凝固酶進(jìn)行陽性對(duì)照,檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。左起第1 列為陽性對(duì)照組,向右分別依次為5、15、28 和41 號(hào)收集液,空白對(duì)照組,血漿自然沉降組。
經(jīng)凝血活性檢測(cè),對(duì)照空白對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果顯示,僅第4 個(gè)峰,即41 號(hào)管收集液具有較高的凝血活性。在觀察凝血活性時(shí),看到紅細(xì)胞邊緣模糊不是十分清晰的即為有凝集效應(yīng)。邊緣較為平整的與空白對(duì)照相近,即沒有凝集活性。
圖3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)照?qǐng)D
圖4 SDS 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
圖5 96 孔板凝血性實(shí)驗(yàn)圖
食物中凝集素對(duì)抗癌藥物的治療作用有增益效果,同時(shí)也能提高癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性,因此凝集素被認(rèn)為是十分重要的活性成分[6]。凝集素是具有不同分子量,且由不同物質(zhì)分子組成的一類物質(zhì),具有極其豐富的多樣性,因而不同植物的凝集素各有不同,研究前景十分廣泛。
本實(shí)驗(yàn)通過生化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作對(duì)大蔥中凝集素進(jìn)行分離,通過凝血活性實(shí)驗(yàn)對(duì)分離物質(zhì)進(jìn)行鑒定,成功從大蔥中分離出有效的活性凝集素物質(zhì)。并通過電泳得到大蔥中凝集素的表觀分子質(zhì)量為41 kDa,為大蔥的食療與生物營養(yǎng)價(jià)值研究提供了參考。