◎ 黃耀雄，甘祥武

（廣州市微生物研究所有限公司，廣東 廣州 510663）

乳酸菌是指發(fā)酵糖類，主要代謝產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌有著相當長的安全使用歷史，長期以來發(fā)酵產(chǎn)品中所使用的乳酸菌普遍被人們認為是安全（GRAS）菌種，并且它還與人以及動物腸道內(nèi)生微生物群落存在著相互作用，產(chǎn)生益生作用，有益于人和動物的健康[2]。

酸奶是以鮮奶為原料，經(jīng)過巴氏殺菌后，添加發(fā)酵劑發(fā)酵后再冷卻灌裝的一種發(fā)酵乳制品。而乳酸菌作為主要發(fā)酵劑，因其良好的發(fā)酵性能，以及益生功效在發(fā)酵食品行業(yè)中占有不可替代的位置。目前國內(nèi)酸奶近幾年發(fā)展迅速，自2013 年至2019 年，酸奶份額占整個乳品市場份額從15%上升至36%，市場潛力非常大，面對這樣的形勢，對酸奶中乳酸菌的研究已然成為了熱點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品為一款來自手工制作的酸奶。

3%過氧化氫溶液、500 mL 新鮮脫脂乳、0.1 moL NaOH 溶液、1.6%溴甲酚紫、氯化鈉、2%酚酞試劑、莫匹羅星鋰鹽、半胱氨酸鹽酸鹽和石蠟油，以上試劑均為國產(chǎn)分析純；MRS 瓊脂培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、MC 瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎培養(yǎng)基和革蘭氏染色液，以上培養(yǎng)基、試劑均購于北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，購于北京艾德萊生物科技有限公司；TaqDNA 聚合酶，購于寶生物工程（大連）有限公司；PCR 擴增所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設備

JE1002 型電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）、BXM-50KB 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、LRH-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、3WLED 型光學顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）、HR50-ⅡA2 型生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）、2720 型PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）、PowerpacTM 基礎型電泳儀（美國BIO-RAD 公司）、AlphaImager EP通用型凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech 公司）及Z216 MK 型離心機（德國HERMLE 公司）。

1.3 酸奶中乳酸菌的分離、純化及鑒定

1.3.1 菌種分離及純化

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）[3]對酸奶進行試驗，分離并純化出菌種。

1.3.2 菌種鑒定

（1）表型特征鑒定。包括菌落特征、色澤、質(zhì)地；個體細胞形狀、革蘭氏染色、芽孢染色等。參照《臨床微生物學診斷與圖解》（第4 版）[4]的方法。

（2）生理生化特征鑒定。①生長試驗。將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管中，滅菌后制成斜面。將分離菌種分別接入試管中，每種菌接4 管，其中3 管作為試驗組，另外1 管作為對照組。將實驗組置于15 ℃厭氧培養(yǎng)，對照組置于36 ℃厭氧培養(yǎng)，24 h 后觀察其生長情況。②過氧化氫酶試驗。將配制好的3%的過氧化氫溶液加入到分離菌種上，若有氣體產(chǎn)生，則過氧化氫酶試驗陽性，無氣體生成則為過氧化氫酶試驗陰性。③碳水化合物發(fā)酵試驗。將配制好的糖發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，按0.5%的比例加入碳水化合物溶液，加棉塞，包扎，經(jīng)121 ℃蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫。在生物安全柜上接種，每種分離菌種接種1 支碳水化合物發(fā)酵管，留1 支碳水化合物發(fā)酵管不接種菌作為空白對照，置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每4 h 觀察一次，并記錄其生長情況。若培養(yǎng)基的顏色改變，則該菌種對這種碳水化合物產(chǎn)酸。本次試驗使用的碳水化合物分別為：七葉苷、乳糖、海藻糖、棉子糖、蜜二糖、松三糖、甘露醇、山梨醇和水楊苷[5-7]。

（3）分子學鑒定。使用試劑盒提取分離菌種DNA，以之作為模板進行目的片段擴增，采用16S rDNA 通用引 物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’），在適宜的反應體系進行PCR 擴增，純化后送樣測序，擴增序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中序列進行比對獲得菌種號相關信息。根據(jù)菌種表型特征鑒定、生理生化特征鑒定、分子學鑒定對分離菌種進行判定。

1.4 酸奶中乳酸菌的性能鑒定

1.4.1 凝固試驗

取新鮮脫脂乳10 mL。置于試管中，加棉塞，包扎后經(jīng)121 ℃蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫。在MRS 肉湯培養(yǎng)基接種試驗菌種，置于36 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，重復活化1 ～3 代。將肉湯培養(yǎng)基分裝于離心管中，在離心機2 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入適量0.9%氯化鈉溶液，混勻，如上述操作重復3次后使用0.9%氯化鈉溶液制備菌懸液，最終濃度在106CFU·mL-1左右。按照1%接種，每種分離菌種接3支試管，留1 支試管不接菌作空白對照，置于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，經(jīng)培養(yǎng)8 h 后每4 h 觀察1 次，并記錄其凝固情況[8]。

1.4.2 產(chǎn)酸試驗

采用酸度滴定法，用吸管吸取5 mL 發(fā)酵乳于100 mL 的三角瓶中，加20 mL 蒸餾水混勻，加入2 ～3滴2%酚酞指示劑，用0.1 moL·L-1氫氧化鈉溶液滴定至出現(xiàn)粉紅色，1 min 不消失為止。對凝固試驗中培養(yǎng)24 h 的發(fā)酵乳進行酸度測試，計算滴定酸度=（滴定消耗的0.l moL·L-1NaOH 毫升數(shù)）×20。

2 結(jié)果與分析

實驗共分離出2 株菌種，分別標作A1、A2。

2.1 表型特征鑒定結(jié)果

通過對菌落進行觀察，革蘭氏染色后放在顯微鏡下觀察，所得到的2 株菌種的形態(tài)特征如表1。由表1可知，分離菌種經(jīng)培養(yǎng)后菌落特征差異較大，A1 菌種菌落白色、隆起、表面粗糙及邊緣整齊，A2 菌種乳白色、凸起、表面光滑及圓形；鏡檢下均為革蘭氏陽性菌，但菌體形態(tài)有所不同，A1 菌種的菌體均為桿狀，單個或成雙排列，而A2 菌種的菌體為球型，單個、成雙或鏈狀排列，符合《臨床微生物學診斷與圖解》（第4 版）中相關乳酸菌的描述，但還無法確定分離出的2株菌種，還需通過生理生化試驗進一步確認。

表1 菌種的形態(tài)特征及鏡檢結(jié)果表

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

由表2 可知，A1 菌種除乳糖試驗為陽性外，其他試驗均為陰性；A2 菌種除15℃生長、乳糖試驗為陽性外，其他試驗均為陰性，根據(jù)《臨床微生物學診斷與圖解》（第4 版）中相關乳酸菌的描述，A1、A2 菌種分別符合為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的生理生化試驗的結(jié)果，還需通過分子學鑒定進一步確認。

2.3 分子學鑒定結(jié)果

A1、A2 菌種測序后與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列比對，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列獲得和該菌種序列相近種、屬的16S rDNA 基因序列，其同源性如表3。根據(jù)表型特征鑒定結(jié)果、生理生化鑒定結(jié)果、分子學鑒定結(jié)果綜合判斷，樣品中分離的A1、A2 菌種經(jīng)鑒定分別為為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。

表2 菌種的生理生化鑒定結(jié)果表

表3 菌種的分子學鑒定結(jié)果表

2.4 菌種的性能鑒定

本文通過凝固試驗、產(chǎn)酸試驗結(jié)果綜合分析分離菌種的性能。由表4 可知，A1 菌種在12 h 出現(xiàn)凝固，在16 h 有乳清析出，培養(yǎng)24 h 后凝固分布不均勻，酸度達到92.3。A2 菌種在20 h 出現(xiàn)凝固，相比A1 菌種的慢，培養(yǎng)24 h 后有乳清析出，但凝固分布不均勻，酸度達到97.2，酸度與A1 菌種的相近。參照《食品安全國家標準 發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）[9]，發(fā)酵乳的酸度≥70 °T，A1、A2 菌種均符合相關要求，但2 株菌種均產(chǎn)生乳清，可能與發(fā)酵條件或其他因素相關。通過對2 種菌種的凝固試驗結(jié)果、產(chǎn)酸結(jié)果綜合分析，2 株菌種的性能良好。

表4 菌種的性能鑒定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本實驗對一款手工制備的酸奶中乳酸菌進行分離、純化，采用了表型特征鑒定、生理生化鑒定和分子學鑒定，確保了菌種鑒定結(jié)果的準確性，分離出2 株乳酸菌，分別為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）。對酸奶中乳酸菌的分離進行討論，按照GB 4789.35—2016的方法可分離出不同屬的乳酸菌，但樣品中若存在多種型的乳桿菌、鏈球菌或雙歧桿菌，通過傳統(tǒng)的生理生化鑒定，不僅耗時長，對檢測人員的能力要求比較高，也無法準確分離及鑒定出所有乳酸菌。目前對于產(chǎn)品中菌種的分析存在許多方法，如API 細菌鑒定系統(tǒng)、藥敏鑒定系統(tǒng)、飛行時間質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)等，也能較好較快地提高工作效率。此外，從產(chǎn)品中分離乳酸菌，也一定程度上解決了乳制品工業(yè)（特別是實驗室基礎研究）菌種的來源問題，并且降低了生產(chǎn)成本、節(jié)約了開支。

通過對從酸奶中分離菌種的性能測試，可得知分離的2 株菌種的性能較好，可用于下一步的基礎研究。酸奶制備過程中，嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種是一種共生關系，嗜熱鏈球菌產(chǎn)甲酸促進保加利亞乳桿菌的生長，德氏乳桿菌保加利亞亞種產(chǎn)氨基酸促進嗜熱鏈球菌的生長，二者產(chǎn)胞外多糖及產(chǎn)酸對酸奶質(zhì)地形成有促進作用，故嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種混合發(fā)酵，可為酸奶的發(fā)酵生產(chǎn)提供很好的思路[10]。下一步，也可通過優(yōu)化發(fā)酵條件生產(chǎn)各種特色的酸奶，從而滿足市場上不同消費人群的口味需求。