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        飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的 不確定度評定

        2021-04-14 03:03:12李光耀史笑娜馬驍杰楊少淼
        現(xiàn)代食品 2021年3期
        關(guān)鍵詞:測量檢測

        ◎ 田 浩,李光耀,張 凡,王 杰,史笑娜,馬驍杰,楊少淼

        (1.河北東淼檢測科技股份有限公司,河北 保定 071000;2.河北納微環(huán)境檢測有限公司,河北 保定 071000)

        2015 年5 月實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》(GB 19298—2014)中增加了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)限量,而不再使用傳統(tǒng)的菌落總數(shù)指標(biāo)對包裝飲用水的衛(wèi)生情況進(jìn)行評價(jià)。根據(jù)國內(nèi)外的研究情況,Nagaveni 等在匈牙利國內(nèi)492 份成品水中的7 份檢出銅綠假單胞菌,該菌的污染率為1.4%[1];魏磊等在中國9 個(gè)省36 家水廠采集的108 個(gè)包裝飲用水樣品中銅綠假單胞菌的污染率達(dá)到了5.6%[2]。

        銅綠假單胞菌分布廣泛,對有機(jī)營養(yǎng)要求較低,對不良環(huán)境抵抗力強(qiáng),世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為人類皮膚污染指示菌;HACCP(Hazard Analysis Critical Control Point)評估明確指出其是嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌,可造成嬰兒腹瀉[3]。由此可知,生活飲用水中的銅綠假單胞菌是一種污染率較高、危害較為嚴(yán)重的衛(wèi)生指示菌。

        《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》(ISO/IEC17025:2005)明確要求認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室需評定和報(bào)告測量不確定度[4];《測量不確定度的要求》(CNAS-CL07:2011)中明確要求“實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有能力對每一項(xiàng)有數(shù)值要求的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評定”[5];CMA(China Metrology Accreditation)評審依據(jù)的《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》明確要求“檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序”[6]。近年來,食品檢測領(lǐng)域的第三方實(shí)驗(yàn)室發(fā)展加速,不確定度評定作為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量、規(guī)范檢測行為的重要手段逐漸受到各方的重視。在實(shí)踐中,微生物檢測數(shù)據(jù)出現(xiàn)臨界值、不符值等非正常值時(shí),正確評定不確定度可以保證檢測結(jié)果的科學(xué)性和公正性[7]。但由于生物學(xué)科本身分散性較強(qiáng)和不易度量的特點(diǎn),不確定度評定的應(yīng)用仍主要存在于非生物類實(shí)驗(yàn)中。

        為探索有效、簡便、適用的微生物實(shí)驗(yàn)不確定度評定方案,本研究針對包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。首先分析不確定度產(chǎn)生來源并分別計(jì)算不同分量產(chǎn)生的不確定度,而后得出合成不確定度和擴(kuò)展不確定度,最后折算回檢測結(jié)果,得到報(bào)告范圍。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》(GB 4789.28—2013)附錄D 要求采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853 銅綠假單胞菌,自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買[8]。本研究采用三代生長期標(biāo)準(zhǔn)菌株。

        包裝飲用水樣品(批號(hào):20170325),自保定市場采購買。使用1.1 中的標(biāo)準(zhǔn)菌株對包裝飲用水樣品進(jìn)行人工污染。

        1.2 儀器與試劑

        3M Petrifilm 致病菌測試紙(環(huán)凱微生物科技有限公司)、滅菌精密250 mL 玻璃量筒(易購安(北京)科技有限公司)、0.1 ℃ ZHSY恒溫培養(yǎng)箱(三洋電機(jī)(中國)有限公司)、ZF-20C 紫外燈(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)、0.45 μm 無菌濾膜(杭州盈天科學(xué)儀器有限公司)、100×顯微鏡(株式會(huì)社日立制作所)、BCD-610W 冰箱(羅伯特·博世有限公司)以及BHC-1300IIA/B2生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

        假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂(編號(hào):20170112F)、金氏B(King’s B)培養(yǎng)基(編號(hào):20170112)、乙酰胺液體培養(yǎng)基(編號(hào):20170119)、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基(編號(hào):160919)、營養(yǎng)瓊脂(編號(hào):20160115)、氧化酶試劑(編號(hào):20160824)以及鈉氏試劑(編號(hào):20170112)。

        1.3 方法

        按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》(GB 8538—2016)中銅綠假單胞菌[9]的要求進(jìn)行檢測,得到原始數(shù)據(jù)。量取250 mL 水樣,0.45 μm無菌濾膜過濾,將濾膜移至CN 瓊脂培養(yǎng)基上,于(36±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;可疑菌落分別計(jì)數(shù)并進(jìn)行確證性實(shí)驗(yàn),確證標(biāo)準(zhǔn)見表1。

        表1 確證性實(shí)驗(yàn)表

        最后進(jìn)行結(jié)果報(bào)告,計(jì)算每250 mL 水樣中的銅綠假單胞菌數(shù)量,結(jié)果以CFU/250 mL 計(jì)。結(jié)果按式(1)進(jìn)行計(jì)算:

        式(1)中,P-呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù);F-顯熒光的菌落數(shù);cF-產(chǎn)氨陽性的顯熒光菌落數(shù);nF-進(jìn)行產(chǎn)氨測試的顯熒光菌落數(shù);R-呈紅褐色的菌落數(shù);cR-產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B 培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù);nR-進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B 培養(yǎng)基上顯熒光測試的紅褐色菌落數(shù)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        設(shè)水樣中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果為T,檢測結(jié)果為X,則T=XCFU/250 mL。

        1.4.1 不確定度的來源

        和一般測量相比較,樣品中微生物測量的結(jié)果特點(diǎn)是發(fā)散性極大[10]。在微生物檢驗(yàn)中,樣品重復(fù)測量帶來的不確定度是影響檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度的主要原因[11]。除此之外,微生物分布、環(huán)境條件、樣品稱量、成品培養(yǎng)基批次、樣品過濾和人員因素均能導(dǎo)致不確定度,其中能夠直接影響檢測準(zhǔn)確度并可以進(jìn)行不確定度評價(jià)的為樣品稱量方面和樣品重復(fù)測量方面,重復(fù)測量帶來的不確定度占主要部分。

        1.4.2 不確定度的評定方法

        根據(jù)對銅綠假單胞菌檢測過程中不確定度的來源進(jìn)行的分析,同時(shí)結(jié)合微生物檢測的學(xué)科特點(diǎn),本研究采用B 類不確定度的統(tǒng)計(jì)方法評定樣品稱量環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度,采用A 類不確定度的統(tǒng)計(jì)方法來評定樣品重復(fù)測量環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度。

        本研究采用人工污染樣品的方式來模擬實(shí)際樣品的檢測,從而獲得足夠的檢測數(shù)據(jù)。實(shí)際的檢測結(jié)果呈現(xiàn)偏態(tài)分布、分散性強(qiáng)、不易評定的特點(diǎn),故首先采用指數(shù)法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使處理后的數(shù)值符合正態(tài)分布,從而評定銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的不確定度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品稱量過程中產(chǎn)生的不確定度

        使用250 mL 無菌玻璃量筒,精度0.1 mL,根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196—2006)規(guī)定,量出式250 mL 量筒的容量允差為±2.0 mL,稱量誤差服從矩形分布,包含因子kp=[12]。

        樣品稱量引入的不確定度ur為:

        2.2 樣品重復(fù)檢測產(chǎn)生的不確定度

        在相同條件下,同一名檢測人員對同一包裝飲用水樣品進(jìn)行重復(fù)檢測30 次,得檢測結(jié)果Xi。檢測結(jié)果見表2。

        表2 檢測結(jié)果表

        得到檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)(Xi)后,將Xi取對數(shù)得lgXi,計(jì)算得對數(shù)值的平均值,再利用貝塞爾公式計(jì)算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方得計(jì)算合并標(biāo)準(zhǔn)偏差得s,最后得樣品重復(fù)檢測合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc。

        合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差:

        樣品重復(fù)檢測合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

        2.3 合成不確定度

        將不同來源的不確定度進(jìn)行合成,得包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的合成不確定度u。

        2.4 擴(kuò)展不確定度

        取置信區(qū)間P=95%,自由度v=30-1=29,查詢t分布表得包含因子k95(29)=2.05,可得包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U。

        2.5 報(bào)告范圍

        根據(jù)得到的擴(kuò)展不確定度U,得到lgX的取值范圍;將lgX取反對數(shù)折算為檢測結(jié)果X,得到X的取值范圍,從而得到包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測結(jié)果T的報(bào)告范圍:

        該包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測結(jié)果為T=23 ~33 CFU/250 mL。

        3 結(jié)論與討論

        2017 年6 月實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》(GB 4789.1—2016)明確要求“檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后,剩余樣品和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢”[13]。微生物項(xiàng)目不得復(fù)檢的特點(diǎn)決定了對其檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性有更嚴(yán)格的質(zhì)量要求,也對其不確定度評價(jià)方案的建立提出了更高的要求。

        不確定度評價(jià)可以定量反映檢測結(jié)果的質(zhì)量好壞,本研究計(jì)算得到的報(bào)出范圍與樣品的實(shí)際檢測結(jié)果較為一致,但是不確定度的評定過程步驟仍然較為繁瑣和不便,中間過程采用了指數(shù)法等統(tǒng)計(jì)方法,主要原因在于微生物實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)普遍呈現(xiàn)偏態(tài)分布,缺少固定規(guī)律、可變性強(qiáng)、重復(fù)性差;這也是微生物檢測項(xiàng)目不易建立規(guī)范的不確定度評價(jià)方案的難點(diǎn)所在。只有在檢測結(jié)果<10 CFU·mL-1的情況下,其才能接近于正態(tài)分布,不需要進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換[14]。本研究采用的為液體樣品且無需進(jìn)行稀釋,如遇其他檢測項(xiàng)目需均質(zhì)、稀釋等過程,不確定度也會(huì)隨之變化。

        不確定度評價(jià)方案的建立首先要分析不確定度產(chǎn)生的來源,微生物實(shí)驗(yàn)有自動(dòng)化儀器少、人員參與多、檢測周期長和結(jié)果統(tǒng)計(jì)主觀性強(qiáng)的特點(diǎn),由此導(dǎo)致不確定度產(chǎn)生的來源較多,主要有樣品重復(fù)檢測、樣品稱量或吸取、無菌室環(huán)境(風(fēng)力、溫度、濕度等)、樣品種類變化、培養(yǎng)基批次變化、樣品均一性及微生物動(dòng)態(tài)變化等,其中培養(yǎng)基批次變化、微生物動(dòng)態(tài)變化等一些微生物實(shí)驗(yàn)特有的不確定度產(chǎn)生來源尚未有完善的測量法或統(tǒng)計(jì)學(xué)的評定方法。這些因素造成的不確定度,需要依靠引進(jìn)自動(dòng)化儀器、嚴(yán)格質(zhì)量控制(實(shí)驗(yàn)室比對、能力驗(yàn)證、質(zhì)量考核等方式)手段來進(jìn)行減少或評定。

        在可評定的因素中,樣品重復(fù)檢測已經(jīng)確定為微生物實(shí)驗(yàn)中的首要不確定度來源,在本研究中其帶來的不確定度為樣品稱量來源的8.1 倍左右。如假設(shè)其他因素均可忽略的話,樣品重復(fù)檢測帶來的不確定度占到全部不確定度的89%左右。目前,我國食品微生物檢測項(xiàng)目逐漸開始使用2 級或3 級的高級別采樣方案(n≥5)進(jìn)行樣品檢測,本文也為其提供了理論依據(jù)。而樣品稱量過程中帶來的不確定度,需要依靠使用優(yōu)良計(jì)量器具、開展器具比對、開展人員比對等方式進(jìn)行減少。

        在實(shí)踐中,微生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不確定度評定的意義主要在于當(dāng)出現(xiàn)要求限值附近的檢測結(jié)果時(shí),利用擴(kuò)展不確定度對樣品進(jìn)行符合性判定。在95%置信概率下,當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果延伸擴(kuò)展不確定度半寬度后仍小于(大于)限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)。當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果低于(高于)限量標(biāo)準(zhǔn)的部分小于測量不確定度,則在95%置信概率上不能做出符合(不符合)限量標(biāo)準(zhǔn)的聲明[15]。

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