◎ 徐晨宇，宋瑩利，王衛(wèi)茜，秦 雯，王 丹

（1.北京城市學(xué)院，北京 100083；2.北京采瑞醫(yī)藥科技研究院有限公司，北京 100094）

鐵皮石斛復(fù)方膠囊是由鐵皮石斛、桑葉、葛根等中藥經(jīng)過適當(dāng)工藝加工而成的具有輔助降血糖功能的保健食品。其中，鐵皮石斛具有養(yǎng)陰益胃、生津止渴的功效，常在中藥方劑中用于治療糖尿病[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明鐵皮石斛具有降血糖的作用。有實驗研究表明鐵皮石斛的水提取物對鏈脲霉素（Streptozotocin，STZ）所致的糖尿病小鼠有顯著的降血糖功效，其效果與對照藥物鹽酸二甲雙胍相近；同時能通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠血脂，改善其脂代謝，間接維護了血糖水平的穩(wěn)定[2]。吳妹等研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛對腎上腺素性高血糖小鼠及鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠有明顯的降血糖作用。其降血糖的胰腺內(nèi)機制是促進胰島B 細(xì)胞分泌胰島素，抑制胰島A 細(xì)胞分泌胰高血糖素，胰腺外機制可能是抑制肝糖原分解和促進肝糖原合成。鐵皮石斛中主要含有多糖、生物堿、菲類等化合物，其中多糖是鐵皮石斛中一類重要的活性物質(zhì)，組成以甘露糖為主且含量較高，與降血糖、增強機體免疫機能等有著密切的關(guān)系。糖類化合物在紫外區(qū)無吸收，多采用示差折光檢測器檢測，但示差折光檢測器靈敏度低，且不能用于梯度洗脫[3]。通過衍生使糖類化合物轉(zhuǎn)變成具有紫外吸收或可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)是提高糖類HPLC 檢測靈敏度的主要手段[4]。本研究先將鐵皮石斛多糖水解成單糖，并與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）進行衍生化后，再采用HPLC 法測定鐵皮石斛復(fù)方膠囊中甘露糖的含量，旨在為鐵皮石斛復(fù)方膠囊品控提供一種有效的質(zhì)量控制手段[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵皮石斛復(fù)方膠囊（批號：19050122、19050222、19050322），中試樣品。

乙腈（色譜純，批號：75-05-8，寒默飛世爾科技有限公司）、甘露糖對照品（批號：C16J8H28561，含量：≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、內(nèi)標(biāo)鹽酸氨基葡萄糖（批號：S27M7I15344，含量：≥98%，上海源葉生物科技有限公司）以及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析純，上海源葉生物科技有限公司）；水為哇哈哈純凈水；甲醇、乙醇、三氯甲烷，均為分析純。

Waters2695 液相色譜儀（2487 紫外燈檢測器，沃特世公司）。

1.2 對照品溶液的制備

校正因子測定：取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成12 mg·mL-1的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對照品約10 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400 μL，加0.5 mol·L-1的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min。再加0.3 mol·L-1的鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3 次，每次2 mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算校正因子（f）[8]。

1.3 供試品溶液的制備

取混合均勻的樣品0.700 g（精確至0.001 g），置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100 mL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，煎煮1 h 并時時攪拌，放冷，加水補至100 mL，混勻，離心，吸取上清液1 mL，置頂空瓶中，加3.0 mol·L-1的鹽酸溶液0.5 mL，封口，混勻，110 ℃水解1 h，放冷，用3.0 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至中性，吸取400 μL，參照校正因子測定方法，自“加0.5 mol·L-1的PMP 甲醇溶液”起，依法操作，取上清液注入液相色譜儀，測定，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.02mol·L-1乙酸銨溶液（17 ∶83，v/v）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL，溫度：室溫。

1.5 甘露糖含量測定的方法學(xué)考察

1.5.1 專屬性考察

參考鐵皮石斛復(fù)方膠囊的處方比例，適量稱取處方中的藥材去除鐵皮石斛，按照1.2 的溶液制備流程，利用同樣的方式來制備陰性對照溶液。分別吸取對照品、供試品和缺鐵皮石斛復(fù)方膠囊陰性對照溶液各10 μL，分別進樣，進行色譜測定。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取鹽酸氨基葡萄糖8.34 mg，置于10 mL 容量瓶中，加水制成0.834 mg·mL-1的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對照品10.77 mg，置于25 mL 容量瓶中，加水制成0.430 8 mg·mL-1的甘露糖對照品母液。分別精密吸取上述甘露糖對照品母液0.50 mL、1.00 mL、3.00 mL 和4.00 mL、5.00 mL 至10 mL 容量瓶中，分別加入上述內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為21.54 μg·mL-1、43.08 μg·mL-1、129.24 μg·mL-1、172.32 μg·mL-1和215.40 μg·mL-1的對照品系列溶液，各吸取400 μL，加0.5 mol·L-1的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3 mol·L-1的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min。再加0.3 mol·L-1的鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3 次，每次2 mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10 μL，注入液相色譜儀，按規(guī)定的色譜條件進樣，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5.3 精密度實驗

精密吸取甘露糖對照品溶液，按照對照品溶液制備方法進行處理，在規(guī)定的色譜條件下連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，并計算RSD值。

1.5.4 重復(fù)性實驗

取同一批次鐵皮石斛復(fù)方膠囊6 份，分別按照供試品溶液制備方法進行溶液制備，在規(guī)定的色譜條件下進樣，記錄峰面積，并計算RSD值。

1.5.5 穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h 和48 h 進樣，記錄目標(biāo)峰的峰面積，并計算RSD值。

1.5.6 加標(biāo)回收率實驗

取適量已知甘露糖含量的鐵皮石斛復(fù)方膠囊內(nèi)容物6 份，精密稱定，分別加入已知含量100%的甘露糖，按照供試品溶液制備方法進行溶液制備，在規(guī)定的色譜條件下進樣，記錄甘露糖峰面積，計算甘露糖的回收率。

1.5.7 樣品含量測定

取3 批鐵皮石斛復(fù)方膠囊，每批取2 份，每份精密稱定1 g，按照供試品制備方法制備供試品溶液，在規(guī)定色譜條件下進樣，記錄色譜峰面積，計算甘露糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性實驗

依據(jù)本產(chǎn)品配方中藥材的功效成分和特征，確定選擇測定的成分為甘露糖。如圖1 所示，色譜峰分離度良好，且陰性對照溶液對甘露糖的測定無干擾，表明本法專屬性強。經(jīng)方法驗證，選擇的成分檢測方法成熟穩(wěn)定可靠，可以用于控制產(chǎn)品質(zhì)量。

圖1 甘露糖專屬性實驗結(jié)果圖

2.2 線性關(guān)系考察

結(jié)果如圖2 所示， 甘露糖對照品濃度在21.54 ～215.40 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，回歸方程為Y=17 184X+15 290。

圖2 甘露糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 儀器精密度考察

供試品按照色譜條件重復(fù)進樣6 次，實驗結(jié)果如表1 所示，甘露糖對照品峰面積RSD為0.22%，內(nèi)標(biāo)峰面積RSD為0.40%，符合RSD≤3%的要求，表明該方法的儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果表明，6 份樣品甘露糖的平均含量為3.62 g/100 g，RSD值為2.31%，符合《中華人民共和國藥典》中關(guān)于重復(fù)性的規(guī)定，表明本方法重復(fù)性良好，符合要求。

2.5 加標(biāo)回收率實驗

表3 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果表明，分別加入已知含量100%的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品后的加標(biāo)回收率在95.90%～102.97%，平均回收率為100.34%，RSD為2.46%，符合《中華人民共和國藥典》的規(guī)定，加標(biāo)回收率實驗符合要求。

表1 儀器精密度考察表

表2 重復(fù)性考察表

表3 加標(biāo)回收率實驗考察表（n=6）

2.6 樣品測定

選取鐵皮石斛復(fù)方膠囊小試樣品，按1.3 方法處理樣品，按1.4 色譜條件測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定表

3 結(jié)論與討論

鐵皮石斛中富含多糖，有研究表明其為發(fā)揮降血糖作用的主要有效物質(zhì)[9]，但鐵皮石斛多糖的成分復(fù)雜，提取純化過程繁瑣，并且在紫外區(qū)無吸收，因此直接采用紫外分光光度法或高效液相色譜法測定挑戰(zhàn)大，且方法不穩(wěn)定。甘露糖是鐵皮石斛中多糖的主要組成成分，因此在多糖研究基礎(chǔ)上，將多糖充分水解為甘露糖，利用甘露糖作為含量檢測指標(biāo)，能間接客觀地評價鐵皮石斛復(fù)方膠囊的質(zhì)量，為建立鐵皮石斛復(fù)方膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考依據(jù)[10]。甘露糖在紫外區(qū)也無吸收，目前對甘露糖等糖類成分多采用示差折光檢測器，但示差檢測器靈敏度較低，且不能梯度洗脫。本實驗通過衍生化使糖類化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶贤馕盏奈镔|(zhì)，提高甘露糖檢測的靈敏度。經(jīng)PMP衍生化的甘露糖，在250 nm 處有強烈的吸收，且衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易分離，分析時其他雜質(zhì)干擾小[11-13]。

本實驗采用藥典方法發(fā)現(xiàn)PMP 的峰和甘露糖的峰無法分開，有相互干擾，在參考藥典方法的基礎(chǔ)上對方法進行了改進，經(jīng)改進后，能夠較好地分離色譜峰，且陰性樣品對結(jié)果不造成干擾，本實驗中線性回歸曲線、檢出限、儀器精密度、重復(fù)性及回收率均符合要求，說明此方法的色譜條件與系統(tǒng)適用性良好，給鐵皮石斛復(fù)方膠囊的質(zhì)量控制提供了參考[14-17]。