◎ 姚子升，朱惠綿，韓詩蕾，黃紀國

（1.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510000；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 510000；3.廣東廣業(yè)清怡食品科技有限公司，廣東 廣州 510000；4.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院，廣東 廣州 510000）

辣木（Moringa oleiferaLam.）屬于辣木科、辣木屬植物，原產(chǎn)于印度北部的喜馬拉雅地區(qū)，是耐旱性及適應(yīng)性較強的速生樹種[1-2]，其根具有辛辣味，因此得名為辣木[3]。辣木主要分布于亞洲、非洲和中美洲的熱帶、亞熱帶國家或地區(qū)。辣木籽油是從辣木種子中提取出的一種植物油脂，其在種子中的含量高達38%～45%，是一種安全且經(jīng)濟價值較高的油料[4]。辣木籽中含有大量的油脂、維生素、蛋白質(zhì)、多糖、可溶性纖維、黃酮及多酚類化合物[5]，是一種營養(yǎng)豐富的食物[6]。辣木籽油含有大量單不飽和脂肪酸，具有良好的抗氧化性、耐煎炸性，是一種食品安全級很高的食用油脂[7-8]，更是一種可與茶油、橄欖油相媲美的高檔植物油[9]。

鑒于辣木獨特的食用功能和藥用價值，近年來，其作為新型非傳統(tǒng)食品來源的研究已在國內(nèi)外引起諸多關(guān)注，辣木開發(fā)主要集中在功能食品的開發(fā)、飼料、水的凈化、化妝品原料及植物生長促進劑和殺菌劑等方面[10-11]，主要集中在辣木籽的油脂、蛋白質(zhì)的提取方法及其理化性質(zhì)的初步研究[12]，以及辣木籽油在食品、化工領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[13-14]。關(guān)于辣木籽殘渣的提取方法與應(yīng)用等方面的綜述少見報道，目前僅有對辣木籽油的特點及食藥用價值方面的研究概述[15]，有關(guān)辣木籽殘渣提取物的利用和功效的影響，以及辣木籽殘渣在功能性食品應(yīng)用研究的綜述尚未見探討。因此，本文從辣木籽殘渣提取物的活性上進行了概括與探討，旨在更好地為辣木籽殘渣的深入研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

辣木籽，產(chǎn)自云南昆明，購自云南昆明辣木生物科技有限公司，經(jīng)過去殼后，60 ℃烘干至恒重，粉碎過80 目篩后保存待用。

95%乙醇；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；無水乙醇、沒食子酸﹑無水碳酸鈉，均為國產(chǎn)分析純；1 mol·L-1福林酚試劑，為南京奧多福尼生物科技有限公司生產(chǎn)；乙酸乙酯為國產(chǎn)分析純，廣州試劑三廠生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DZF-150 型數(shù)顯小型真空干燥箱和SHB-Ш 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、TGL-168 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、AR-1140/C 型電子分析天平（上海金鵬分析儀器有限公司）、RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（上海霄漢實業(yè)發(fā)展有限公司）、超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、微量連續(xù)可調(diào)移液器（上海江岳電子科技有限公司）及HB120-50-05型超臨界提取裝置（江蘇宏博機械制造有限公司）。

1.2 辣木籽殘渣提取物的制備

烘干后的辣木籽經(jīng)干燥粉碎后，均勻裝入5 L 超臨界提取罐中，采用段瓊芬等人的方法[8]進行提取辣木籽油（提取6 次，每次4 h），將收集提取的辣木籽油低溫保存?zhèn)溆?，將CO2超臨界提取過后的辣木籽殘渣揮發(fā)干凈，先后依次采用用乙酸乙酯（液質(zhì)比1 ∶25）、水（液質(zhì)比1 ∶25）進行超聲浸提（提取2 次，每次0.5 h），過濾；濾液經(jīng)真空減壓濃縮干燥，依次得到乙酸乙酯提取物，水提取物。最終，將辣木籽油，乙酸乙酯提取物和水提物低溫保存。

超臨界二氧化碳萃取法：段瓊芬等用超臨界CO2流體萃取辣木籽油，得到最佳提取條件為：萃取溫度35 ℃，分離溫度40 ℃，CO2流量為20 kg·h-1，萃取壓力20 MPa，出油率為36.3%，提取率為97%[16]。

1.3 實驗步驟

在辣木籽粉的提取物中，Singh 等[17]發(fā)現(xiàn)游離和結(jié)合形式的酚類物質(zhì)存在，且通過不同的體外實驗，綜合1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、鐵還原抗氧化能力及總抗氧化能力來驗證其抗氧化活性。

1.3.1 對DPPH 自由基清除活性的測定

參考魯俊華等[18]的方法，并做出部分修改。200 μmol·L-1DPPH 溶液的配制：稱取19.7 mg 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，95%乙醇在250 mL 容量瓶定容。樣液配制：乙酸乙酯提取物，水提取物以及超臨界萃取物均以50%乙醇分別配制質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1、8 mg·mL-1、6 mg·mL-1、4 mg·mL-1和2 mg·mL-1的溶液。

向2 mL 的DPPH 溶液中加入不同濃度的2 mL 樣品溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min 后，517 nm 檢測吸光值A(chǔ)1。向2 mL 的DPPH 溶液中加入2 mL50%乙醇溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min 后，517 nm 檢測吸光值A(chǔ)2。向2 mL 的95%乙醇溶液中加入不同濃度的2 mL樣品溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min 后，517 nm 檢測吸光值A(chǔ)3。按式（1）計算其清除率。

式（1）中，A2=0.675 3，A3=1.010 1。

1.3.2 對羥基自由基（OH·）清除活性的測定

參考金鳴等[19]的方法：1.865 mmol·L-1鄰二氮菲溶液配制：稱取0.185 g 鄰二氮菲粉末用無水乙醇溶解定容至500 mL。1.865 mmol·L-1的FeSO4·7H2O 溶液配制：稱取0.259 g 的FeSO4·7H2O 粉末用水定容至500 mL。配 制0.2 mol·L-1的pH7.4 的PBS 以 及0.03%（v/v）的H2O2。 取1.0 mL 濃 度 為1.865 mmol·L-1鄰 二 氮菲的無水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2 mol·L-1的pH7.4 磷酸鹽緩沖液2 mL 和1 mL 不同濃度的樣品，充分混勻后加入1.0 mL 濃度為1.865 mmol·L-1的FeSO4·7H2O 溶液，再次混勻后加入1.0 mL 0.03%（v/v）的H2O2，于37 ℃恒溫水浴，60 min 后，在536 nm 下分別測量各組混合溶液的吸光度值得A1。以磷酸鹽緩沖液代替樣品作為損傷組測吸光度值得A2。以磷酸鹽緩沖液替代樣品和H2O2作為未損傷組，測其吸光度值A(chǔ)3。按式（2）計算其清除率。

式（2）中，A2=0.675 3，A3=1.010 1。

1.3.3 對超氧自由基清除活性的測定

參考林祥潮等[20]的方法。30 mmol·L-1鄰苯三酚溶液配制：準確稱取0.189 2 g 鄰苯三酚，用10 mmol·L-1的鹽酸溶液溶解后，定溶于50 mL 容量瓶，需現(xiàn)配。Tris-HCl 緩沖液（pH9.0）：將50 mL 0.1 moL·L-1Tris溶液與7.0 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液混合，加水稀釋至100 mL。天青Ⅰ溶液：2.0×10-4mol·L-1。取兩支試管，分別加入2 mL 天青Ⅰ溶液和0.6 mL 的Tris-HCl 緩沖液，向其中一支加入0.4 mL 的鄰苯三酚溶液作為陽性對照組，另一只不加鄰苯三酚作為陰性對照組，加水定容至10 mL。室溫下反應(yīng)10 min。在602 nm 處測定體系的吸光度，陰性對照組為A0，陽性對照組為A1，超氧自由基的產(chǎn)生量可由?A=A0-A1表示。

按照以上步驟，加入天青Ⅰ和緩沖液后，再向其中加入1 mL 的不同濃度的樣品溶液，再加入0.4 mL鄰苯三酚溶液，定容至10 mL。室溫下反應(yīng)10 min，測其吸光值A(chǔ)2。按式（3）計算其清除率。

式（3）中，A0=0.255 2，A1=0.139 7。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽殘渣提取物對DPPH 自由基的清除作用

DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對電子在517 nm 波長處有最大吸收，因此其可與抗氧化活性物質(zhì)結(jié)合，使其在517 nm 波長處的吸收消失或減弱[21]。根據(jù)表1 數(shù)據(jù)得辣木籽殘渣提取物清除DPPH 自由基的濃度-清除率關(guān)系。說明各種樣品所建立的方程非?？煽浚忉屃死蹦咀烟崛∥餄舛扰c清除率之間一一對應(yīng)關(guān)系。由圖1 可知，水相提取物的DPPH 自由基清除率隨濃度上升而增大，乙酸乙酯相提取物對DPPH 的清除率明顯高于水相，在濃度為6 mg·mL-1時達到最大值，清除率為97.14%。

表1 辣木籽殘渣提取物對DPPH 自由基的清除率表

圖1 辣木籽殘渣各提取物對DPPH 自由基的清除率圖

2.2 辣木籽殘渣提取物對羥自由基的清除作用

鄰二氮菲-Fe2+作為一種常用的氧化還原指示劑，可與H2O2作用產(chǎn)生羥自由基，通過指示劑顏色的變化判斷待測物質(zhì)的羥自由基清除作用[21]。根據(jù)表2 數(shù)據(jù)得辣木籽殘渣提取物清除羥自由基的濃度-消除率關(guān)系。從表2 可以看出，各實驗組的羥自由基清除率和濃度呈正相關(guān)，而水相提取物的羥自由基清除能力大于乙酸乙酯相，這與本實驗其他結(jié)果抗氧化性不一致，這可能與辣木籽殘渣提取物本身的化學結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對不同體系和不同自由基的作用存在一定的選擇性。圖2 說明各種樣品所建立的方程可行，且非?？煽?，能較好的解釋辣木籽提取物清除羥基自由基的濃度-清除率關(guān)系。

表2 辣木籽殘渣提取物對羥基自由基的清除率表

圖2 辣木籽殘渣各提取物對羥自由基的清除率圖

2.3 辣木籽殘渣提取物對超氧自由基的清除作用

鄰苯三酚在堿性溶液中的自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，可迅速氧化指示物質(zhì)天青I 使其褪色，通過溶液吸光度的變化測定物質(zhì)的超氧自由基清除能力[22]。根據(jù)表3 數(shù)據(jù)得辣木籽殘渣提取物清除超氧自由基的濃度-清除率關(guān)系。結(jié)果表明，各實驗組的清除超氧自由基的能力隨著樣品濃度的升高而增加，其中乙酸乙酯相對超氧自由基的清除能力最強，當濃度達到8 mg·mL-1時，對超氧自由基的清除率達到95.50%。圖3 說明各種樣品所建立的方程可行，解釋了辣木籽殘渣提取物的濃度與超氧自由基清除率之間的一一對應(yīng)關(guān)系。

表3 辣木籽殘渣提取物對超氧自由基的清除率表

圖3 不同組分辣木籽提取物對超氧自由基的清除能力圖

3 結(jié)論

本研究分別測定了辣木籽殘渣提取物對DPPH 自由基、羥基自由基、超氧自由基的清除能力。結(jié)果表明，辣木籽殘渣提取物對DPPH 自由基、羥基自由基、超氧自由基均有一定的清除能力，且隨濃度的增大而逐漸增強，其中乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最強，其對DPPH 自由基、羥基自由基、超氧自由基的清除率都較高。本研究為辣木籽殘渣的深入研究及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供了理論支持與借鑒，有望應(yīng)用到功能性食品中，具有廣泛的應(yīng)用前景。