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        堿提法提取大球蓋菇多糖工藝 及其清除氧自由基研究

        2021-04-14 03:02:32錢春強(qiáng)林文飛吳德平劉南億
        現(xiàn)代食品 2021年3期

        ◎ 錢春強(qiáng),林文飛,吳德平,劉南億

        (1.宜興市好禧蟲草專業(yè)合作社,江蘇 宜興 214200;2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食藥用菌研究所,浙江 杭州 310058)

        大球蓋菇(Stropharia rugoso-annulata)又名皺環(huán)球蓋菇、赤松茸、大紅菇等,是一種營(yíng)養(yǎng)豐富,口感細(xì)嫩的珍稀食用菌。大球蓋菇具有較強(qiáng)的抗雜和抗逆能力,適種季節(jié)廣,栽培過程中分泌的胞外纖維素酶可以很大程度上降解纖維素、木質(zhì)素,可以利用多種農(nóng)林廢棄資源[1-3]。其栽培模式多樣,栽培技術(shù)易于掌握,不需要復(fù)雜栽培設(shè)施,可以在林地和農(nóng)閑田進(jìn)行栽培[4]。栽培后的菌渣仍含有多種有機(jī)質(zhì),可作為肥料直接還田[5],有利于改良土壤結(jié)構(gòu),增進(jìn)土壤肥力,促進(jìn)微生物活動(dòng)和作物根系發(fā)育,同時(shí)在一定程度上緩解農(nóng)林廢棄資源到處堆放而造成的環(huán)境問題,有利于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢物綜合利用,具有較好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。

        大球蓋菇是我國(guó)20 世紀(jì)末從歐洲引進(jìn)的一種珍稀食用菇種,被世界糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)評(píng)為最值得向發(fā)展中國(guó)家推薦的“營(yíng)養(yǎng)、健康”菇種。大球蓋菇子實(shí)體中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素、氨基酸及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),脂肪含量低,并含有牛磺酸、維生素C 等生物活性物質(zhì)[6]。其中,多糖是食用菌中的主要活性成分之一,種類豐富,活性和含量較高,可以提高生物體的免疫力,具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤等功效。大球蓋菇堿性多糖主要以半乳糖為主,還有甘露糖,葡萄糖,阿拉伯糖組成的雜多糖[7]。

        本文對(duì)大球蓋菇堿性多糖的提取溫度、時(shí)間和堿液濃度3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,通過正交分析確定了其最佳提取工藝參數(shù)。本文通過過硫酸銨/N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(AP/TEMED)體系檢測(cè)大球蓋菇堿性多糖對(duì)氧自由基(O2-·)的清除率,對(duì)大球蓋菇堿性多糖的氧自由基清除作用進(jìn)行了初步研究,為大球蓋菇堿性多糖的生物活性研究提供了一定的數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        新鮮大球蓋菇,購(gòu)自江蘇宜興當(dāng)?shù)厥袌?chǎng);氫氧化鈉、硫酸、重蒸苯酚、過硫酸銨(AP)、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺三羥甲基氨基甲烷(Tris),鹽酸(HCl)及冰醋酸,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶,購(gòu)自Sigma 公司;N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)。

        透析袋(分子量6 000 ~14 000)、UV-3802 型紫外/可見分光光度計(jì)(北京高能科迪科技有限公司)、R201-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi 公司)、5430 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)以及真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康儀器公司)。

        1.2 多糖提取方法

        1.2.1 預(yù)處理

        新鮮的大球蓋菇切片凍干后粉碎,置于真空干燥器內(nèi)儲(chǔ)藏。

        1.2.2 水浴浸提

        稱取適量大球蓋菇粉末置于燒杯中,根據(jù)需求按不同的水浴溫度、浸提時(shí)間、堿液濃度進(jìn)行熱水浸提,在浸提過程中使用電動(dòng)攪拌器對(duì)其進(jìn)行不停地?cái)嚢?。得到浸提液進(jìn)行抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,以便下一步處理。

        1.2.3 除蛋白

        對(duì)上述多糖進(jìn)行脫蛋白處理,加入1%木瓜蛋白酶,60 ℃酶解4 h,再用Sevage法連續(xù)作用至溶液澄清,在波長(zhǎng)280 nm 處無蛋白吸收峰即可[8]。

        1.2.4 醇沉

        加入80%無水乙醇(v/v),靜置過夜后棄去上清液,收集沉淀,冷凍干燥后得到大球蓋菇堿性粗多糖樣品。

        1.3 多糖得率測(cè)定方法

        標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別量取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL,不足1 mL 的用蒸餾水補(bǔ)至1 mL。然后加1 mL 的5%苯酚、5 mL 濃硫酸,靜置10 min。37℃水浴20 min 后在490 nm 測(cè)定吸光度A490。以蒸餾水做空白對(duì)照。

        樣品測(cè)定:吸去1 mL 多糖待測(cè)液,按照上述方法測(cè)定A490。多糖得率由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得[9]。

        1.4 單因素試驗(yàn)

        以溫度(40℃、55℃、70 ℃、85 ℃和100 ℃)、時(shí)間(0.5 h、1.0 h、2.0 h、3 h 和4 h)、堿液濃度(0.005 mol·L-1、0.010 mol·L-1、0.020 mol·L-1、0.030 mol·L-1和0.040 mol·L-1)等3 個(gè)主要因素,分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)來確定大球蓋菇堿性多糖的最佳提取參數(shù)。

        1.5 正交試驗(yàn)

        采用L9(33)正交試驗(yàn)對(duì)上述單因素試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì),并進(jìn)行方差分析確定該多糖提取的最佳工藝。試驗(yàn)因素和水平見表1。

        表1 L9(33)正交試驗(yàn)因素和水平表

        1.5.1 大球蓋菇堿性多糖清除O2-·試驗(yàn)

        過 硫 酸 銨/N,N,N′,N′- 四 甲 基 乙 二 胺(AP/TEMED)體系可以產(chǎn)生O2-·,而該O2-·能與羥胺溶液反應(yīng)生成NO2-,后者經(jīng)對(duì)氨基苯磺酸和α-萘胺顯色在波長(zhǎng)530 nm 處有特征吸收峰[10]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過研究大球蓋菇多糖對(duì)AP/TEMED 產(chǎn)生的O2-·的清除率來判斷其抗氧化活性。AP/TEMED 溶液的配制參照表2。

        表2 AP/TEMED 體系溶液配制表[11-12]

        在室溫條件下,吸取A 液0.4 mL,B 液1.6 mL于20 mL 具塞試管中混勻,反應(yīng)1 min;分別加入0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.8 mg·mL-1的大球蓋菇堿性多糖溶液1 mL、10 mmol·L-1的鹽酸羥胺0.4 mL,振蕩混勻,靜置反應(yīng)20 min;加 入17 mmol·L-1對(duì) 氨 基 苯 磺 酸2 mL 和7 mmol·L-1α-萘胺2 mL,震蕩混勻,并反應(yīng)25 min。用等體積的正丁醇對(duì)顯色液進(jìn)行萃取,4 000 r·min-1離心15 min,在530 nm 處測(cè)定有機(jī)相吸光度值。按式(1)計(jì)算O2-·清除率。

        式(1)中,A-對(duì)照液的A530值;B-待測(cè)液的A530值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

        由圖1 可知,當(dāng)提取溫度為85 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到最高值,為6.29%,其中多糖得率隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),這是由于溫度過高會(huì)引起多糖糖苷鍵斷裂,多糖降解。

        圖1 提取溫度對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

        由圖2 可知,提取時(shí)間從0.5 h 提高到1.0 h,多糖得率增幅極大,當(dāng)時(shí)間增加至2 h 時(shí),多糖得率達(dá)到最高點(diǎn),為6.21%。

        圖2 提取時(shí)間對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

        由圖3 可知,隨堿液濃度提高,多糖得率先增加后減小,并在堿液濃度為0.02 mol·L-1時(shí),多糖得率達(dá)到峰值。

        圖3 堿液濃度對(duì)大球蓋菇堿性多糖得率的影響圖

        2.2 多糖工藝的正交試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選定以下3 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn),其分析結(jié)果參見表3。

        由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析可知,影響大球蓋菇堿性多糖得率的諸因素大小順序是:溫度(A)>堿液濃度(B)>時(shí)間(C),最佳組合為A2B3C3,即提取溫度為85 ℃,堿液濃度為0.03 mol·L-1,提取時(shí)間為2 h。在此條件下,大球蓋菇堿性多糖得率為6.98%。

        2.3 正交試驗(yàn)的方差分析

        為判斷上述3 因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是否存在,將正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,找出其中起主導(dǎo)作用的變異來源,其結(jié)果見表4。

        表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

        表4 正交設(shè)計(jì)方差分析表

        由表4 可知,3 個(gè)因素中提取溫度對(duì)多糖得率具有極顯著性影響(P<0.05),提取時(shí)間和堿液濃度的影響均不顯著(P>0.1),其中,對(duì)多糖得率的影響最不顯著的是提取時(shí)間,這與正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

        2.4 大球蓋菇堿性多糖對(duì)O2-·的清除作用

        由表5 可知,大球蓋菇堿性多糖對(duì)O2-·的清除作用呈濃度依賴性,在多糖濃度為0.8 mg·mL-1時(shí),其清除率達(dá)到80.12%。因此,可以看出大球蓋菇堿性多糖具有較好的O2-·清除作用,這和地鱉蟲多糖相似[13]。

        表5 多糖對(duì)O2-·的清除率表

        3 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及方差分析,確定了大球蓋菇堿性多糖的最佳工藝條件:浸提溫度85 ℃,堿液濃度0.03 mol·L-1,提取時(shí)間2 h,在此工藝條件下,多糖得率達(dá)到6.98%。方差分析表明,浸提溫度是影響大球蓋菇堿性多糖得率的主要因素,而提取時(shí)間和堿液濃度的影響較小。對(duì)最佳工藝條件下提取的大球蓋菇堿性多糖進(jìn)行O2-·清除能力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其具有較好的O2-·清除作用,也即具有較好的抗氧化能力,至于其清除DPPH 和·OH 自由基的能力還有待進(jìn)一步研究。本研究為大球蓋菇的生物活性研究及產(chǎn)學(xué)研一體化奠定了基礎(chǔ)。

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