吳桐，劉曉東

（中國藥科大學藥學院藥物代謝研究中心，江蘇 南京 210009）

ATP 結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉運體是一種包含多種跨膜轉運體的轉運蛋白家族合稱，在包括磷脂、固醇、膽汁酸、肽類及各種藥物在內的多種底物跨膜運輸中起到重要作用。這些轉運體通過和ATP 結合后水解產生的能量，將特異性底物逆濃度梯度泵送到細胞外側。在人類中共鑒定出49 種ABC 轉運蛋白，并將其分為7 組（ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG）。P-gp（P-glycoprotein）作為ABC家族的成員之一，最早發(fā)現主要表達于多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）細胞中；近來發(fā)現在腸上皮細胞、肝臟、腎小管上皮細胞和腦血管內皮細胞中均有表達。P-gp 主要功能是通過介導外源化合物的外排轉運來保護這些器官，但同時也阻礙腸道內藥物吸收及藥物向腦內分布。P-gp 被認為是參與包括胰腺癌和白血病在內的多種癌細胞MDR 現象的重要轉運體[1-2]。

針對P-gp 在疾病發(fā)生和治療過程中的重要作用以及P-gp 功能和表達的調控因素已有廣泛研究。其中包括維拉帕米（verapami）、環(huán)孢素A（cyclosporin A）、長春新堿（vincristine）等在內的P-gp 抑制劑，通過改變ATP 水解酶活性、競爭性占據結合位點等方式抑制P-gp 的功能，但也存在著和其他藥物相互作用誘導毒性的風險[3]。先前筆者所在課題組的研究結果證實，在大鼠肝性腦病疾病模型中，體內膽紅素和血氨等特異性物質升高引發(fā)的炎癥及氧化應激反應，將會激活包括核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）和細胞外蛋白調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2）等信號通路，對P-gp 的功能和表達起調控作用[4-5]。糖尿病狀態(tài)下肝臟內P-gp 表達會升高，腸道內的P-gp 表達將會下降[6]。P-gp 主要在細胞膜上發(fā)揮功能，mRNA 水平翻譯之后，通過ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白家族錨定在膜上，其中脂筏（lipid raft）區(qū)域在P-gp 轉運通道的形成中起重要作用，微囊蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）定位于小窩（caveolae），作為脂筏上一種重要蛋白成分，與P-gp 結合調節(jié)其結構和功能（見圖1）。本文將圍繞P-gp 在膜上的定位與轉運過程，闡釋相關蛋白對于P-gp 膜上的功能和表達的調控作用。

圖1 ERM 及caveolin-1 對P-gp 在膜上的定位和功能調控機制Figure 1 Regulation of ERM and caveolin-1 on P-gp location and function on cell membrane

1 P-gp 轉運體

P-gp 最早在中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現，因其具有阻止細胞毒性藥物進入細胞的功能，將其命名為通透性糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）。P-gp是一個相對分子質量為170 000 的ABC 轉運蛋白，由1 280 個氨基酸組成，是一種由人類MDR1基因編碼的能量依賴性藥物外排轉運體。人P-gp 由2 個對稱的氨基N-末端和羧基C-末端盒式結構組成，具有43%的相似性，并且每個盒式結構均包括6 個跨膜段，其上帶有ATP 結合基團。P-gp 先與ATP結合再水解，通過這一過程釋放能量，來達到轉運的目的[7-9]。

P-gp 高表達通常見于一些富集轉運體的組織處引發(fā)的腫瘤，例如胰腺癌、結腸癌、肝癌、腎上腺癌和腎癌[1,10]，通常在卵巢、乳腺和食道及胃的腫瘤中觀察到低水平的P-gp 表達[11-12]，然而在例如肺癌和淋巴瘤的化療過程中會升高P-gp 的表達水平，從而導致MDR 發(fā)展[13-14]。在正常組織中，P-gp 也有表達，并且發(fā)揮著特殊的生理作用。在肝臟中，P-gp表達在肝細胞膽管側膜，在腎臟中P-gp 主要位于近曲小管的上皮細胞的腔側面。由于P-gp 在肝臟和腎臟的特殊位置，促進藥物從肝細胞側排向膽管或從腎小管上皮細胞外排至尿液，參與藥物膽汁排泄和腎清除過程[15]。結腸和空腸的上皮細胞腔側面表達有P-gp，具有限制口服藥物吸收進入血液的作用，這成為口服藥物生物利用度低的重要原因之一[16]。P-gp 也高表達于腦微血管內皮細胞的腔側膜上，其功能是防止毒素和藥物進入腦內，成為中樞神經系統(tǒng)的“守門人”[17-18]。

2 ERM 蛋白對P-gp 的作用

2.1 ERM 蛋白家族

ERM 蛋白家族由埃茲（ezrin，Ezr）蛋白、根（radixin，Rdx）蛋白和膜突（moesin，Msn）蛋白3 種相似蛋白組成，集中于富含肌動蛋白的細胞表面，在細胞骨架和細胞膜之間起連接作用。ERM 由包含300 個氨基酸殘基的FERM（erythrocyte band four point one Ezrin-Radixin-Moesin）結構域和約200 個氨基酸殘基組成的中段α-螺旋區(qū)域及100 個氨基酸殘基構成的C-末端構成。在細胞膜結構中，ERM 氨基端FERM 和C-末端分別與質膜和肌球蛋白位點結合，在細胞的黏附、形態(tài)構建和質膜功能蛋白質的定位過程中發(fā)揮重要作用[19-20]。

2.2 ERM 蛋白對P-gp 膜定位和轉導的調控作用

通常用P-gp 的mRNA 水平作為判斷其活性的指標，但一些研究顯示P-gp 的mRNA 水平并不總與其活性水平相關[19,21-22]。如小腸中P-gp 的mRNA水平，從十二指腸到回腸段呈現增加的趨勢。文獻報道顯示，P-gp 的底物維拉帕米在十二指腸、空腸和回腸段均被吸收，最大外排出現在空腸段[21]。在回腸的上端至中段區(qū)域內mRNA 水平呈降低趨勢，但在末端達到最高[22]，而P-gp 底物羅丹明123（rhodamine 123，Rho 123）在回腸中段觀察到最大外排[19]。

只有定位在細胞質膜（plasma membrane）上P-gp才能顯示其外排活性。作為質膜蛋白的連接蛋白，ERM 家族在其調控過程中扮演了重要的角色。有研究顯示，在小鼠小腸內P-gp 的mRNA 和蛋白水平從頂端至底部呈現升高的趨勢，Rdx 蛋白也呈現相同的趨勢。同野生型小鼠相比，Rdx基因敲除小鼠在小腸中下部質膜上P-gp 的表達顯著降低，進而影響外排Rho123 作用，其P-gp 的mRNA 水平未見明顯改變[23]。在人結腸腺癌細胞 (Caco-2)模型中，沉默Rdx也顯著降低細胞膜上P-gp 的表達，但對細胞膜的功能未造成影響。沉默Ezr和Msn并沒有影響到細胞膜上P-gp 的表達[24-25]，上述結果提示在小腸上主要由Rdx 參與細胞膜上P-gp 的定位調節(jié)。

在人體外血腦屏障模型細胞系（hCMEC/D3）中，沉默Rdx也能顯著降低P-gp 在膜上的表達；而抑制Msn可降低P-gp 的外排活性，但并沒有影響到P-gp 在膜上的分布。沉默Ezr對于P-gp 在膜上的表達和功能均未產生影響，證實在hCMEC/D3 細胞中Ezr 對于P-gp 無調控作用[26-27]。另有文獻報道，在嗎啡誘導5 d 后小鼠原代腦血管細胞中，Msn 和P-gp 膜蛋白表達均顯著升高，其總蛋白水平不變。免疫熒光沉淀也證實Msn 和P-gp 的膜共定位[28]。上述研究結果也證實，在血腦屏障上的P-gp 膜定位受到Rdx 和Msn 的影響，結構上與Msn 存在相關性，Ezr 未對P-gp 產生調控行為。肝臟炎癥的大鼠上也發(fā)現P-gp 表達隨著Rdx 水平的降低而降低[29]。同時有研究證明，在人肝癌細胞系（HepG-2）中，沉默Rdx也導致細胞膜上P-gp 表達減少，總蛋白水平不變，沉默Msn未見類似的改變，而沉默Ezr降低了P-gp 的mRNA 水平。說明在肝細胞膜P-gp 的定位同樣和Rdx 有關聯(lián)，Ezr 在翻譯水平上影響了P-gp的表達[30]。腎臟中尚未見P-gp 膜上定位的改變同ERM 蛋白家族調節(jié)有關的報道。

上述結果部分驗證了ERM 蛋白家族在P-gp 膜定位中作用。P-gp 在翻譯后被糖基化，隨后被運送至質膜并插入質膜，在質膜中活化的ERM 蛋白與P-gp 連接以穩(wěn)定其膜定位。因此，ERM 家族蛋白的表達調節(jié)將直接影響P-gp 在質膜上的定位，進而影響P-gp 活性。

3 Caveolin-1 蛋白對P-gp 的作用

3.1 脂筏與caveolin-1 蛋白

細胞膜是由膽固醇、磷脂、糖脂和蛋白質構成的磷脂雙分子結構，其中蛋白以覆蓋、貫穿、嵌入3 種方式和膜連接。脂筏是細胞膜上由鞘脂和膽固醇組成的特殊脂質微區(qū)，因為鞘脂包含更長和更多的飽和脂質尾巴，所以鞘脂/膽固醇脂質筏要比周圍甘油磷脂組成的膜環(huán)境更厚且流動性更差。迄今為止，各種對于脂筏結構的研究將脂筏的結構定義為一種小窩結構，即在細胞膜上呈現燒瓶狀內陷，并且被Cav-1 包被[31]。

Cav-1 是小窩主要的膜內在蛋白，其相對分子質量為22 000，其特征是具有異常的發(fā)夾狀構象，其中N 端和C 端區(qū)域均面向細胞質[32]。Cav-1 和許多蛋白質相互作用。在腦部Cav-1 可以通過抑制基質金屬蛋白酶對緊密連接蛋白的分解作用來保護血腦屏障的完整性[33]。在肝臟中，Cav-1 作為一種調控蛋白，參與到肝臟的脂質蓄積、葡萄糖代謝和肝細胞生殖等多種生理活動中[34]。Cav-1 還參與到多種調節(jié)細胞功能的信號通路環(huán)節(jié)中。如Cav-1 的下調可激活ERK 信號通路，從而減少了細胞的遷移[35]。

3.2 脂筏上caveolin-1 對P-gp 的調控

P-gp 屬于跨膜蛋白，對于所處細胞膜周圍的脂質環(huán)境非常敏感，P-gp 和脂筏區(qū)域有著密切的聯(lián)系。P-gp 在脂筏區(qū)域的表達與細胞系種類和細胞裂解技術有關，并和Cav-1 的表達存在一定的相關性。如在人結腸癌高表達多藥耐藥蛋白細胞系（HT-29-MDR）和人乳腺癌細胞系（MCF-7/AdrR）中，P-gp在脂筏區(qū)域的表達高達38% ～ 40%[36]。在過表達P-gp的AuxB1 細胞和耐藥細胞CHRC5 中觀察到P-gp 和Cav-1 共定位。在腦腫瘤組織中同樣觀察到P-gp 位于富含Cav-1 的微囊結構中，P-gp 和Cav-1 共同表達于管腔內皮間室[37]。Cav-1 與P-gp 蛋白共膜定位，Cav-1 與P-gp 相互作用形成了高分子復合物，以此調控P-gp 活性。當小窩結構被抑霉菌素破壞，P-gp的轉運活性也受到了影響[38]。這些研究表明P-gp在脂筏區(qū)域高度表達，小窩可能是P-gp 發(fā)揮外排轉運功能的主要區(qū)域，其活性也受到該區(qū)域的膽固醇和糖脂等多方面因素影響。

目前對于Cav-1 與P-gp 的研究主要集中在腦組織及相關體外模型。在大鼠腦內皮細胞系RBE4 中，小干擾RNA（siRNA）下調Cav-1 的表達后，P-gp底物紫杉醇和長春新堿在RBE4 中的累積分別降低了約38%和40%，這一過程通過降低Cav-1 表達減弱了與P-gp 的相互作用，進而增加P-gp 的轉運活性。用酪氨酸激酶處理使得Cav-1 磷酸化后，紫杉醇和長春新堿的累積分別增加了27%和30%。提示Cav-1 的磷酸化增強Cav-1 和P-gp 之間的相互作用，從而抑制了P-gp 的轉運功能[39]。另一項研究使用H2O2處理人體外血腦屏障模型hCMEC/D3，在20 min 內顯著降低P-gp 外排轉運活性，并降低了其在膜上的表達，但總蛋白含量并沒有受到影響，這說明P-gp 在膜上的功能和表達受到細胞內部翻譯后的調控，氧化應激同樣增加了Cav-1 的磷酸化，增強了Cav-1 同P-gp 之間的作用，導致P-gp 外排活性降低，去除氧化應激后，P-gp 的活性恢復[40]。

關于Cav-1 與P-gp 之間的關聯(lián)在1998 年就被報道[41]。Cav-1 的過表達可誘導細胞膜上膽固醇水平的降低，抑制P-gp 的活性[42]。在人乳腺癌細胞MCF-7/ADR 中，Rack1 受體通過調節(jié)Cav-1 磷酸化在不改變P-gp 蛋白水平的條件下調節(jié)其轉運活性[43]。Abl 和Scr 等酪氨酸激酶能夠引發(fā)Cav-1 的磷酸化，進而增強Cav-1 與P-gp 相互作用，抑制P-gp 外排活性，而下調Cav-1 表達則會增強P-gp 外排活性，說明Cav-1 對于P-gp 功能呈現負性調節(jié)作用。Dynamin 家族是一類鳥苷酸三磷酸酶（guanylate triphosphatase），是細胞在進行內呑（endocytosis）過程中的一種特異性蛋白，它參與囊泡從細胞膜上出芽和剪切的過程。有報道指出，磷酸化的Cav-1與dynamin 蛋白協(xié)同作用，可引導細胞微囊表面的內吞作用，與P-gp 形成的復合物因內吞作用被內化，導致了P-gp 的外排效果降低[44]。

4 結語

P-gp 部分定位在脂筏區(qū)域，其功能的調節(jié)與脂筏區(qū)域的脂質和蛋白環(huán)境有著密切關系。質膜上的膽固醇和鞘脂對P-gp 功能的發(fā)揮也起到一定影響[45-46]，脂筏作為質膜上脂質分子富集的區(qū)域，形成了有利于P-gp 信號轉導和定位的細胞環(huán)境。在星形膠質細胞等細胞中均發(fā)現了關于P-gp 在小窩環(huán)境中的免疫標記，并與Cav-1 共定位，在耐去污劑的細胞膜結構中也證實了P-gp 同細胞骨架之間的聯(lián)系[47]。此外，有研究報道，通過免疫沉淀證實ERM 蛋白家族與P-gp 共定位，并且作為連接P-gp 同肌動蛋白和細胞膜結構的支架蛋白一起存在于脂筏區(qū)[48]。ERM 蛋白的表達改變及磷酸化會影響P-gp 在膜上的表達，進而對跨膜運輸作用產生直接影響，作為骨架蛋白，ERM 參與了P-gp 翻譯后在質膜上的表達過程。Cav-1 蛋白作為構成脂筏區(qū)的主要調控蛋白，通過小窩蛋白結合基序在P-gp 的36 ～ 44 位氨基酸與P-gp 相互作用，導致P-gp 外排活性降低，對P-gp 的跨膜運輸活性起到負向調節(jié)作用，磷酸化的Cav-1 會進一步加強這種作用。通過對ERM 和Cav-1 的研究，對于從質膜內的蛋白角度闡釋P-gp在膜上功能和表達改變的機制提供了新的思路，對疾病狀態(tài)下P-gp 的特異性改變提供了研究方向，對MDR 等現象開發(fā)抑制性藥物提供了新的靶點。