王藍晨，王昱，王穎，楊仕賽，朱貴明

(貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院 實驗中心，貴州 貴陽 550025)

家蠅(MuscadomesticaL.)屬于完全變態(tài)昆蟲，是世界大部分地區(qū)最常見的一種昆蟲[1]。家蠅具有生育能力強、生命周期短、易于高密度培養(yǎng)等特點，且育種技術(shù)簡單，飼料來源豐富，已被列為世界上新的蛋白質(zhì)資源昆蟲[2-4]。因此將家蠅作為一種新型的轉(zhuǎn)基因生物反應器進行研究，具有廣闊的發(fā)展前景。昆蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用功能基因開發(fā)新昆蟲品種的關(guān)鍵，也是實現(xiàn)昆蟲有用蛋白質(zhì)合成和生物反應器開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)[5-6]。外源基因能否成功表達，啟動子的選擇顯得尤其重要[7]。目前，對家蠅的轉(zhuǎn)基因研究相對不成熟，技術(shù)體系的建立尚不完善，仍缺乏能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因高效表達的理想啟動子。在果蠅和家蠶中，肌動蛋白(Actin)是一種具有收縮特性的高度保守的組成型蛋白[8]，肌動蛋白除存在于肌肉細胞中，還是細胞骨架的重要組成部分、參與細胞遷移、染色體分離及細胞內(nèi)大分子轉(zhuǎn)運等[9]。肌動蛋白5C(Actin-5C)屬細胞質(zhì)肌動蛋白，通常認為將它祝為表達外源目的基因的啟動子比較合適[10-11]。本研究使用多種預測工具預測Actin-5C啟動子區(qū)，并克隆預測調(diào)控區(qū)域，重組到含螢火蟲熒光素酶的報告基因pGL3-Basic載體上，為進行下一步的實驗研究篩選出啟動子活性最強的家蠅Actin-5C啟動子的調(diào)控區(qū)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1家蠅及細胞來源 供試蟲源家蠅由貴州醫(yī)科大學生物與工程學院昆蟲房飼養(yǎng)，溫度25～28 ℃，濕度70%，光照周期12 L ∶12 D。供試細胞sf9(草地貪夜蛾)為貴州醫(yī)科大學生物與工程學院實驗室保存。家蠅幼蟲經(jīng)麥麩飼養(yǎng)，家蠅成蟲以白糖和奶粉以1 ∶1比例混合進行飼養(yǎng)，飲用水為無菌蒸餾水。

1.1.2主要試劑 熒火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic和pGL3-Promoter購于美國Promega公司，Q5?超保真2× 預混液、限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，DNA Marker、純化回收試劑盒及2×TaqPCR MasterMix Ⅱ購自天根生化科技(北京)有限公司，氯化鈉、酵母粉及胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，瓊脂糖購自中國biosharp公司，DNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自德國PAA公司，Grace′s昆蟲培養(yǎng)基和細胞轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo ScientificTM公司。Primer 5.0設計引物(表1)、引物合成及基因測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 PCR實驗中使用的引物Tab.1 Primers used in PCR experiments

1.1.3主要儀器 Applied Biosystems PCR儀購自美國Thermo ScientificTM公司，DYY-BC型電泳儀購自北京市六一儀器廠，Milli-Q超純水儀購自德國Millipore Pharmacia，超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1啟動子分析 在美國國家生物信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中檢索家蠅肌動蛋白Actin-5C基因gDNA序列，使用生物信息學預測工具分析得到啟動子區(qū)，其中啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點預測使用的是Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)，啟動子預測分析使用伯克利果蠅基因組計劃(berkeley drosophila genome project,BDGP)在線分析軟件，以及Softberry 啟動子預測分析工具包(包括TSSG、TSSP和FPROM)，轉(zhuǎn)錄元件的預測使用的是Cister(https://zlab.bu.edu/～mfrith/cister.shtml)。

1.2.2熒光素酶載體構(gòu)建 Primer 5.0軟件進行引物設計，DNASTAR軟件行酶譜分析，在上游和下游引物5′端分別引入XhoⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點和保護堿基(表1)。提取家蠅成蟲DNA并以此為模板，采用超保真聚合酶擴增相應的目的片段。PCR條件為98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，共35個循環(huán)，最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產(chǎn)物。XhoⅠ和KpnⅠ內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物及載體pGL3-Basic純化回收后進行連接反應，得到的質(zhì)粒分別命名為pGL3-1156、pGL3-1745及pGL3-2059三種質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切及測序進行鑒。

1.2.3瞬時轉(zhuǎn)染細胞及熒光素酶基因的表達 取sf9細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板中，細胞90%融合時，加無血清無雙抗Grace′s培養(yǎng)基100 μL/孔，再加空載體pGL3-Basic和pGL3-Promoter各4 μg作為對照組，pGL3-1156、pGL3-1745及pGL3-2059各4 μg為實驗組，轉(zhuǎn)染時加內(nèi)參載體phRL-TK400 ng和Lipofectamine2000 10 μL，補充無血清無雙抗的培養(yǎng)基250 μL，置28 ℃ 孵箱培養(yǎng)。6 h后棄培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)基。24 h后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測螢火蟲熒光素酶基因的表達情況，上游引物Fluc-F為5′ TGCCTCATAGAACTGCCTGCGTG 3′，下游引物Fluc-R為5′ TATCATCCCCCTCGGGTGTAATCAG 3′。PCR擴增時64 ℃退火，延伸40 s，循環(huán)30次，產(chǎn)物長度為420 bp；并以βactin作為內(nèi)參照，上游引物βactin-F為5′ GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC 3′，下游引物βactin-R為5′ TGTCACGCACGATTTCCCTCTC 3′，PCR擴增時62 ℃退火，延伸10 s，循環(huán)30次，產(chǎn)物大小約為250 bp。結(jié)束后取反應液5 μL進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 家蠅Actin-5C基因定位及啟動子分析

在線軟件NCBI對Actin-5C(NW_004766441)基因結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示Actin-5C基因在GenBank數(shù)據(jù)庫中位于Scaffold 20349上，基因全長為5 359 bp。使用BDGP在線分析Actin-5C基因啟動子，以Actin-5C基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子(ATG)的第一個堿基A作為+1，Actin-5C基因5′端上游-2 609～-94 bp區(qū)域內(nèi)有啟動子活性，且啟動子分值達0.8以上，其中-2 198～-2 148 bp時的分值最高，達到0.98(表2)。使用軟件TSSG、TSSP、Promoter 2.0和FPROM預測Actin-5C啟動子基因序列，將預測結(jié)果匯總后制圖(圖1)。使用Cister預測轉(zhuǎn)錄元件，在-220 bp處檢測到CAAT盒信號；在-1 444 bp處檢測到TATA盒信號(表3)。經(jīng)比較取最有可能的1 156 bp(-1 236～-80 bp)、1 745 bp(-1 825～-80 bp)和2 059 bp(-2 139～-80 bp)截斷啟動子片段構(gòu)建pGL3-1 156、pGL3-1 745及pGL3-2 059三種質(zhì)粒。

表2 BDGP啟動子預測工具預測Actin-5C基因非編碼區(qū)序列中的啟動子Tab.2 BDGP promoter prediction tool for Actin-5C promoter in non-coding region sequence

圖1 多種啟動子預測軟件預測Actin-5C基因啟動子Fig.1 A variety of promoter prediction software to predict the Actin-5C gene promoter

表3 Cister預測轉(zhuǎn)錄元件列表Tab.3 Cister predictive transcriptome list

2.2 家蠅Actin-5C轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

提取家蠅基因組DNA，并根據(jù)已經(jīng)報道的Actin-5C基因預測啟動子區(qū)，以家蠅基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR產(chǎn)物與載體pGL3-Basic經(jīng)同樣的酶切回收，回收片段大小分別為1 156、1 745及2 059 bp，片段大小正確；將回收后的目的片段連接到報告基因pGL3-Basic載體上，轉(zhuǎn)化篩選單克隆并提取陽性重組質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒pGL3-1 156，pGL3-1 745，pGL3-2 059，片段大小正確；經(jīng)Blast比對分析結(jié)果顯示堿基序列正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖2和圖3。

圖3 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果(節(jié)選)Fig.3 Sequencing results of recombinant plasmids(Excerpt)

2.3 熒光素酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄檢測

將3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細胞后RT-PCR逆轉(zhuǎn)cDNA，以cDNA為模版檢測熒光素酶編碼基因，轉(zhuǎn)錄結(jié)果表示3個重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)錄成功(圖4)。

注：A為家蠅基因組DNA，B為酶切PCR產(chǎn)物，C為重組質(zhì)粒，D為雙酶切鑒定；M為DNA分子量標準Marker。圖2 啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid using promoter

注：A為RT-PCR檢測結(jié)果，B為內(nèi)參；M為DNA分子量標準Marker，1為陰性對照，2為未轉(zhuǎn)sf9，3為pGL3-Basic，4為重組質(zhì)粒pGL3-1156，5為重組質(zhì)粒pGL3-1745，6為重組質(zhì)粒pGL3-2059，7為陽性質(zhì)粒pGL3-Promoter。圖4 RT-PCR檢測重組質(zhì)粒Fig.4 RT-PCR detection of recombinant plasmids

3 討論

具有轉(zhuǎn)錄起始特異性的啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5′末端上游的非編碼DNA序列，可以活化RNA聚合酶并使RNA聚合酶精確結(jié)合DNA模板，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核心區(qū)域[12-13]；真核生物啟動子在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中有著非常重要的作用，是RNA聚合酶特異性結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件[14-15]。利用生物信息學預測啟動子，對于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究這是一種重要的方法，它可以有效地從基因組中找到已知和未知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，為基因結(jié)構(gòu)和功能的研究提供可靠的依據(jù)[16-17]。在真核基因表達調(diào)控系統(tǒng)中，基因轉(zhuǎn)錄的起始和調(diào)控主要通過順式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶的協(xié)同作用實現(xiàn)[18]。順式作用元件在起始位點和基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄效率中起決定性作用[19]，并且基因的轉(zhuǎn)錄起始通常通過啟動子實現(xiàn)[20]。啟動子序列由核心元件TATA盒、正向核心啟動子元件BRE、反向啟動子元件DPE、啟動子、CAAT盒和GC盒組成，這些都是通過生物信息學研究啟動子的重要信息[21-23]。本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫對Actin-5C基因結(jié)構(gòu)定位分析，對Actin-5C基因5′端正向3 898 bp序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子區(qū)和核心啟動子區(qū)；利用Promoter 2.0軟件預測該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點；通過Cister軟件預測，對非編碼區(qū)序列進行分析，發(fā)現(xiàn)Actin-5C基因有TATA盒信號，也有CAAT盒信號，經(jīng)預測評分初步確定Actin-5C啟動子的核心區(qū)域。

研究啟動子需要生物信息學預測工具或軟件，它可以大大簡化理解基因的過程，通過預測和基因比對，人們可以更充分地了解基因及其編碼的蛋白質(zhì)[24]。生物信息學預測工具或軟件等作為指引科研實驗方向的輔助工具，其結(jié)果必須經(jīng)過實驗研究進一步證明[25-26]。目前常借助一些報告基因如雙熒光素酶報告基因(luciferase)、綠色熒光蛋白報告基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)等瞬時表達，根據(jù)報告基因的表達情況，確定啟動子中的一些相應元件的部位、功能及特性[18,27]。

對于家蠅分子生物學的研究與蠶、果蠅等昆蟲相比，其理論研究不夠深入，比如基因組特點、功能等，基因的表達調(diào)控是其發(fā)揮生物功能、調(diào)節(jié)機體生命過程的基礎，而啟動子是表達調(diào)控的關(guān)鍵，構(gòu)建新的家蠅啟動子片段報告基因載體是成功進行轉(zhuǎn)基因家蠅研究的必要條件。本研究將Actin-5C基因生物信息學分析得到的結(jié)果，根據(jù)基因啟動子的分析，克隆并成功構(gòu)建不同啟動子片段報告基因載體，為分析家蠅轉(zhuǎn)基因載體的表達特征、家蠅轉(zhuǎn)基因細胞系的建立以及轉(zhuǎn)基因家蠅的養(yǎng)成奠定了基礎，為研究Actin-5C基因啟動活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，探討基因表達調(diào)控機制提供了實驗依據(jù)。轉(zhuǎn)基因家蠅是一個大工程，啟動子效率的研究尤為重要，實驗至此構(gòu)建的3個重組質(zhì)粒載體，初步檢測均具有活性，為今后實驗篩選出最強啟動子提供了條件，具有重要意義。