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        止血精膠囊止血活性評價(jià)及穩(wěn)定性考察*

        2021-04-13 08:07:58梅瑤關(guān)煥玉廖尚高席曉嵐
        關(guān)鍵詞:白芨粗提物肝素

        梅瑤,關(guān)煥玉,廖尚高,席曉嵐

        (貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴安新區(qū) 550025;國家苗藥工程技術(shù)中心 &民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心,貴州 貴陽 550004)

        白芨(Bletillastriata)為蘭科植物白芨的干燥塊莖,多年生草本,是歷版《中國藥典》收載的常用藥之一[1-2],具有收斂止血、消腫生肌、清熱利濕之功效[3-8],在臨床上主要用于咯血、吐血以及外傷出血、皮膚皸裂、瘡瘍腫毒、肺結(jié)核吐血、潰瘍病出血等病癥[8-15]。白芨總提物經(jīng)大孔樹脂色譜柱進(jìn)行組分分離后,去除了強(qiáng)水溶性成分和強(qiáng)親脂性成分,獲得的白芨的80%乙醇洗脫組分(BS-80EE)中含有大量的非多糖類化合物[16]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[17-20],白芨非多糖組分能夠顯著縮短肝素化的小鼠凝血時(shí)間(bleeding time,BT)和出血時(shí)間(clotting time,CT);可刺激大鼠血小板活化,增強(qiáng)血小板聚集;可作用于凝血纖溶系統(tǒng),加速血液凝固,抑制纖維蛋白降解;同時(shí)使血液黏度增加,血流速度變慢發(fā)揮止血作用。白芨非多糖組分化學(xué)成分豐富,且止血療效顯著。為了進(jìn)一步開拓白芨非多糖的應(yīng)用,本課題組在前期研究中,通過濕法制粒,將白芨非多糖和輔料微晶纖維素以1 ∶1比例制成顆粒后,裝入膠囊殼制得止血精膠囊,該制劑和白芨非多糖粉末相比,降低了白芨非多糖粉末的吸潮性,進(jìn)而也提高了白芨非多糖的穩(wěn)定性。然而,止血精膠囊的止血活性仍未進(jìn)行考察和驗(yàn)證,且在生產(chǎn)、貯存與使用期間過程中的穩(wěn)定性也未行考察。因此,本文以小鼠全身肝素化的BT和CT作為指標(biāo),比較白芨粗提物與白芨非多糖止血精膠囊的止血療效,并參照2015版《中國藥典》四部通則9001原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則[21],以水分、性狀、崩解時(shí)限及含量測定等為指標(biāo),對該制劑進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

        1 資料與方法

        1.1 藥品、動物、儀器

        1.1.1藥品 止血精膠囊(實(shí)驗(yàn)室自制)、militarine對照品(批號DST-190219-100,成都德思特生物技術(shù)有限公司)、云南白藥(YNBY,批號ZLA1736 20181210,云南白藥集團(tuán)股份有限公司)、肝素鈉注射液(批號1113H0212,江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司),乙酸乙酯、氯仿、硫酸均為分析純,甲醇為色譜純,水為屈臣氏水。

        1.1.2動物 清潔級昆明小鼠共180只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司 ,許可證號SCXK(湘)2019-0005。實(shí)驗(yàn)期間動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下,保持室溫18~24 ℃,環(huán)境安靜,動物隨意進(jìn)食進(jìn)水,明暗12 h循環(huán)飼養(yǎng)。所有動物于試驗(yàn)前24 h禁食不禁水。

        1.1.3儀器 十萬級AE2401型電子天平(梅特勒,托利多儀器上海有限公司)、CX250型超聲波清洗機(jī)(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)、SC082767型實(shí)驗(yàn)室專用純水機(jī)(四川沃特水處理設(shè)備有限公司)、DZF-6050真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、ZB-1d型升降崩解儀(南京溫諾儀器有限公司)、Aglient 1260型高效液相色譜儀、藥品穩(wěn)定試驗(yàn)箱(上海三騰儀器有限公司)、HT-D40型恒溫箱(深圳市宇泰試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1白芨粗提物的提取 白芨塊莖經(jīng)粉碎機(jī)打成粉末,稱取白芨粉末2 kg,按料液比分別為1 ∶10、1 ∶8、1 ∶8的比例加入蒸餾水,煎煮提取3次,1 h/次,合并3次提取液,過濾,濃縮至浸膏,55 ℃真空干燥得白芨粗提物29.41 g,提取率為6.8%。

        1.2.2止血精膠囊的制備 白芨塊莖經(jīng)粉碎機(jī)打成粉末(過4號篩),按料液比1 ∶4的比例加入95%乙醇回流提取,2 h/次,提取3次。合并3次濾液后濃縮至浸膏,浸膏用水溶解后上大孔樹脂D101柱色譜(樹脂6 cm,75 cm),經(jīng)水洗脫后,用80%乙醇溶液洗脫,收集并合并80%乙醇洗脫液,濃縮至稠膏,55 ℃真空干燥,制得白芨非多糖浸膏粉,浸膏粉(過60目篩)與稀釋劑微晶纖維素按1 ∶1混勻,加入一定量的75%乙醇作為潤濕劑(噴灑加入、少量多次)制軟材直至“手握成團(tuán)、觸之即散”。過20目篩擠壓制粒,將濕顆粒于60 ℃下干燥,取干燥好的顆粒整粒,過40~80目篩,去除細(xì)粉,即得粒度介于40~80目的膠囊填充物,裝入3號空心膠囊,即得止血精膠囊。

        1.2.3止血精膠囊止血活性考察 (1)全身肝素化小鼠CT的測定。取健康昆明小鼠90只,雌雄各半,隨機(jī)分為9組(每組10只),為空白對照組、云南白藥組(0.667 g/kg)、肝素鈉模型組(70 U/kg)、白芨粗提物低、中、高劑量組(按生藥量計(jì)為2.5、5.0和10.0 g/kg)和止血精膠囊低、中、高劑量組(按生藥量計(jì)為2.5、5.0和10.0 g/kg)。各組小鼠每天灌胃給藥1次,空白組和模型組分別按20 mL/kg劑量給予蒸餾水,其余各組均給予相應(yīng)劑量的藥物,連續(xù)給藥5 d;末次灌胃給藥60 min后,除空白組外其余各組均尾靜脈注射肝素鈉(70 U/kg),15 min后用手術(shù)刀于距小鼠尾尖0.5 cm處割斷,待血液自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí),每隔30 s用濾紙吸去血滴1次,直至血液自然停止(濾紙吸時(shí)無血跡)。以人工形成創(chuàng)面出血到出血停止所經(jīng)時(shí)間計(jì)為小鼠CT。(2)全身肝素化小鼠BT的測定。取健康昆明小鼠90只(雌雄各半),隨機(jī)分為10組,每組10只,分組及給藥方法同“全身肝素華小鼠CT的測定”;于第5天灌胃給藥60 min后,除空白組外其余各組均尾靜脈注射肝素鈉(70 U/kg),15 min后用眼科彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球即有血液流出 ,于載玻片上滴 1滴血(血滴直徑約 5 mm)后立即記時(shí),每隔30 s用清潔大頭針自血滴邊緣由外向內(nèi)輕輕挑動 1次,并觀察有無血絲挑起,從采血開始至挑起血絲止,記錄所用時(shí)間即為BT。

        1.2.4止血精膠囊穩(wěn)定性考察 (1)高溫試驗(yàn):取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量,置于潔凈的培養(yǎng)皿中,置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放至第5天和第10天取樣,按《中國藥典》2015版四部通則9001法規(guī)中規(guī)定檢測重點(diǎn)檢查項(xiàng)目,與0天測定結(jié)果比較;如果樣品含量下降5%,則需要在40 ℃條件下同法進(jìn)行試驗(yàn)。(2)高濕試驗(yàn):取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量于潔凈的培養(yǎng)皿中,置于溫度為25 ℃、濕度為(75±5)%恒溫培養(yǎng)箱中,放置5 d和10 d后取樣,按相關(guān)要求按相關(guān)要求對膠囊外觀性狀、水分、崩解時(shí)限、白芨苷含量及薄層進(jìn)行檢測。(3)強(qiáng)光照射試驗(yàn):取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量置于光照為(4 500±500) lx的光照箱中,分別在第5天和第10天取樣測定。(4)加速試驗(yàn):隨機(jī)抽取3批自制止血精膠囊,分別用鋁箔紙包裹嚴(yán)密,置于溫度為(40±2)℃、相對濕度為(75± 5)%的恒溫培養(yǎng)箱中,分別于第3個月、第6個月取樣1次,按止血精膠囊穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目,以水分、性狀、崩解時(shí)限、白及苷含量及薄層為指標(biāo)進(jìn)行測定。

        1.2.5白芨苷含量的測定 (1)色譜條件:Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 nm×5 μm),保護(hù)柱為Phenomenex Security Guard C18;柱溫40 ℃,流動相為甲醇 ∶水(40 ∶60),檢測波長為223 nm,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣體積10 μL;理論塔板數(shù)以白芨苷計(jì)數(shù)應(yīng)不低于5 000,白芨苷與其它色譜峰分離度>1.5。(2)對照品溶液的制備:精密稱取白芨苷標(biāo)準(zhǔn)品5.09 mg,置于10 mL量瓶中,甲醇溶解定容后,制成濃度為0.509 g/L的儲備溶液,取儲備液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL,分別置于25 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,混勻,制得濃度為40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列對照品溶液,白芨苷檢測濃度線性范圍為5.09~40.72 mg/L。(3)供試品溶液的制備:稱取膠囊內(nèi)容物0.2 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流處理2 h,冷卻至室溫,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾,精密量取續(xù)濾液5 mL轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,即得。(4)陰性樣品溶液的制備:按照止血精膠囊處方比例及制備工藝,制備缺白芨非多糖組分的陰性樣品溶液,按“供試品溶液的制備”方法處理,即得。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 止血精膠囊與白芨粗提物體內(nèi)藥效考察

        小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后,與空白組比較,模型組小鼠的CT和BT明顯延長(P<0.01),說明小鼠出血模型建模成功(圖1)。與模型組相比,止血精膠囊和白芨粗提物各劑量組均能明顯縮短全身肝素化小鼠的CT和BT(P<0.01或P<0.05),呈劑量依賴性;止血精膠囊組小鼠的BT、CT縮短率均較白芨粗提物組高。與云南白藥組比較,止血精膠囊高劑量組小鼠的BT和CT縮短(P<0.01),而白芨粗提物高劑量組小鼠的BT和CT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);止血精膠囊低、中、高劑量組的BT和白芨粗提物低、中、高劑量組相比,縮短率分別增加了20.7%、19.7%、15.9%,而CT分別增加了11.6%、13.7%、25.2%。因此推測止血精膠囊體內(nèi)止血活性優(yōu)于白芨粗提物。

        注:(1)與空白組比較,P<0.01;與肝素鈉模型組比較,(2)P<0.05,(3)P<0.01。圖1 止血精膠囊和白芨粗提物不同劑量組對全身肝素化小鼠BT、CT的影響Fig.1 Effects of different dosages of hemostatic capsules and bletilla striata extracts on BT and CT of heparinized mice

        2.2 止血精膠囊穩(wěn)定性考察

        經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)處理后,對止血精膠囊外觀性狀、水分、崩解時(shí)限以及白芨苷含量進(jìn)行考察。

        2.2.1影響因素試驗(yàn) (1)高溫試驗(yàn):樣品經(jīng)0、5、10 d高溫(60 ℃)試驗(yàn),3批膠囊內(nèi)容物仍呈黃棕色顆粒、含水量分別為4.82%,4.75%和5.02%,均低于9.0%;崩解時(shí)限分別為5、6和6 min,崩解時(shí)間無變化(P>0.05);3批膠囊白芨苷含量分別為26.72、26.63和26.52 mg/g,含量無明顯變化(P>0.05),表明膠囊在高溫下穩(wěn)定。(2)高濕試驗(yàn):樣品在溫度為25 ℃、相對濕度為(75 ± 5)%的高濕度環(huán)境下進(jìn)行0、5、10 d試驗(yàn),3批膠囊內(nèi)容物含水量分別為4.82%、4.75%和5.02%,崩解時(shí)限無明顯變化(P>0.05),白芨苷含量分別為26.72、25.42和25.92 mg/g,表明膠囊在高濕下較穩(wěn)定。(3)強(qiáng)光照射試驗(yàn):樣品經(jīng) 0、5、10 d (4 500±500)lx 強(qiáng)光照,3批膠囊內(nèi)容物仍均為黃棕色顆粒,含水量均低于9.0%(分別為4.90%、3.28%、2.15%),崩解時(shí)限均<30 min,符合藥典對硬膠囊的規(guī)定;3膠囊白芨苷含量分別為26.459、26.508、26.526 mg/g,即白芨苷含量物無明顯變化(P>0.05),表明膠囊在強(qiáng)光照射下穩(wěn)定。

        2.2.2加速試驗(yàn) 由表1可知,樣品經(jīng)6個月加速試驗(yàn)的考察,其性狀、有關(guān)物質(zhì)、含量等與0月比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明本品在常規(guī)包裝時(shí)比較穩(wěn)定。

        表1 止血精膠囊加速試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of accelerating test of hemostatic capsules

        3 討論

        白芨作為我國傳統(tǒng)的生肌止血藥,在臨床上具有顯著意義[22-23]。前期研究已發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分具有較強(qiáng)的止血活性,利用高壓液相色譜—電噴霧—四級桿—飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)指認(rèn)了白芨非多糖部位的12個色譜峰,發(fā)現(xiàn)其中的單體化合物4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside、blestroside和gymnoside I等能顯著促進(jìn)血小板聚集作用。白芨苷、4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside和α-isobutylmalic acid等化合物可顯著縮短肝素化小鼠的CT 值[20]。為了避免白芨非多糖組分粉末的吸潮性,本課題組通過白芨非多糖組分的膠囊劑工藝制備,獲得止血精膠囊,并對止血精膠囊的止血活性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評價(jià),發(fā)現(xiàn)止血精膠囊能夠明顯縮短小鼠全身肝素化的CT和BT,且止血活性強(qiáng)于白芨粗提物,為白芨藥材及其制劑的開發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。

        在進(jìn)行樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)考察時(shí),根據(jù)2015版中國藥典四部對膠囊劑穩(wěn)定性(指導(dǎo)原則9001),取3批市售制劑,進(jìn)行10 d的影響因素試驗(yàn)和6個月的加速試驗(yàn),除了對主要成分白芨苷薄層鑒定和含量測定外,還分別考察了外觀形狀、含水量以及崩解時(shí)限,均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。說明在目前采用的模擬市場包裝下,該產(chǎn)品在6個月內(nèi)其內(nèi)在質(zhì)量和穩(wěn)定性良好,這也為以后該藥品的儲存條件和生產(chǎn)條件提供了可靠的理論依據(jù)。

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