陳墅鑫，羅莎莎，張吉澳，李長(zhǎng)玲,2，黃翔鵠,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518000）

威氏海鏈藻 (Thalassiosira weissflogii) 隸屬于中心硅藻綱 (Centricae) 海鏈藻屬 (Thalassiosira)，是我國(guó)南方養(yǎng)殖蝦塘的優(yōu)勢(shì)藻種之一[1-3]。其富含多不飽和脂肪酸，尤其是EPA和DHA，可促進(jìn)對(duì)蝦幼體的生長(zhǎng)發(fā)育，可作為對(duì)蝦開(kāi)口餌料或橈足類(lèi)等浮游動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化餌料，已廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦育苗[4]。

威氏海鏈藻可有效去除養(yǎng)殖水體中的氨氮，有凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的功能。王培明等[5]利用威氏海鏈藻和側(cè)孢短芽胞桿菌（Brevibacillus laterosporus）組成的菌藻聯(lián)合體吸收水體氨氮，指出威氏海鏈藻為菌藻復(fù)合體吸收氨氮的主要貢獻(xiàn)體，其最高貢獻(xiàn)率可達(dá)84%。因此，定向培養(yǎng)威氏海鏈藻有重要意義。鹽度是微藻生長(zhǎng)的重要生態(tài)因子，然而，已有研究主要針對(duì)綠藻門(mén)和硅藻門(mén)部分種類(lèi)在不同鹽度條件下對(duì)于某物質(zhì)的吸收或者同化效果等，鮮見(jiàn)關(guān)于威氏海鏈藻藻細(xì)胞在不同鹽度下的適應(yīng)性研究。本研究分析在不同鹽度條件下威氏海鏈藻生長(zhǎng)和生化組分變化，為定向培育威氏海鏈藻并應(yīng)用于養(yǎng)殖池塘水環(huán)境水質(zhì)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用威氏海鏈藻由廣東海洋大學(xué)藻類(lèi)資源開(kāi)發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)南方對(duì)蝦池塘分離純化并保種。取指數(shù)生長(zhǎng)期藻液用于實(shí)驗(yàn)。

主要儀器有上海博訊BSG-300光照培養(yǎng)箱、250 mL三角錐瓶（蜀牛）。采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)不充氣密封培養(yǎng)。培養(yǎng)體積為200 mL。實(shí)驗(yàn)初始接種密度為5×105個(gè)/mL，實(shí)驗(yàn)期間光/暗周期為16 h L/8 h D，溫度為 (28 ± 0.5) ℃，照度為 (3000 ± 100) lx，pH 8.0 ± 0.2。實(shí)驗(yàn)鹽度梯度為5、15、25、35、45，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)周期為8 d。每天早中晚3次定期搖勻藻液，每2 d取樣1次。

1.2 藻細(xì)胞密度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間，每次取樣后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（25 mm×16 mm）在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)威氏海鏈藻細(xì)胞密度。比生長(zhǎng)率μ(d-1) 計(jì)算：

式中，N1和N0分別是t1和t0時(shí)的細(xì)胞密度。

1.3 色素含量測(cè)定

采用熱乙醇提取法[6]。用5 μm的混合纖維素膜收集5 mL藻液，棄濾液，將收集的濾膜置冰箱-20 ℃條件下暗處理16 h，加入體積分?jǐn)?shù)為95%、80 ℃預(yù)熱的乙醇5 mL，置于80 ℃水浴鍋中2 min，避光室溫靜置4 h，以5 000 r/min離心10 min，用分光光度計(jì)測(cè)定上清液在480、510、630、664、750 nm處測(cè)定光密度值D。根據(jù)下式計(jì)算葉綠素a[7]和類(lèi)胡蘿卜素[8]含量。

ρ(葉綠素a)=11.47×D664-0.40×D630，

ρ(類(lèi)胡蘿卜素)=7.6 × [(D480-D750) -1.49 × (D510-D750)]。

式中，D480、D510、D630、D664、D750分別為480、510、630、664、750 nm下光密度。

1.4 藻細(xì)胞可溶性總糖含量測(cè)定

用苯酚硫酸法[6,9]測(cè)定，葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

Y=0.005 4X+0.260 3，R2=0.998 7，

其中，Y為光密度值，X為葡萄糖濃度（μg/mL）。

樣品前處理參照韓謙等的堿提法[9]。每次取藻液5 mL，于5 000 r/min 條件下離心10 min，去除上清液，用各鹽度梯度海水洗滌兩次。加入0.305 mol/L的NaOH溶液1 mL，混勻，置58.5 ℃下水浴68 min，以5 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液用于可溶性總糖含量的測(cè)定。

1.5 藻細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定

參照洪廷等[10]方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。每次取2.5 mL藻液，以5 000 r/min 離心10 min，去除上清液，用各梯度海水洗滌2次，藻泥加入0.305 mol/L的NaOH溶液1 mL，混勻，置74.5 °C下水浴69 min。以5 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液，用考馬斯亮藍(lán)法[6,11-12]測(cè)定總蛋白含量。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

Y=0.002 4X+0.736 4，R2=0.997 2，

其中，Y為光密度值，X為總蛋白質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.6 藻細(xì)胞中性脂含量測(cè)定

取藻液適量，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸藻細(xì)胞至350 nm下光密度值D(350 nm) 為1.0。取1 mL藻液，以5 000 r/min離心5 min，去除上清液，藻細(xì)胞沉淀用PBS洗2次，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)20%二甲基亞砜溶液。于38 ℃下水浴18 min，每1 mL藻液加入20 μL尼羅紅染料（質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL丙酮溶液），混勻，染色5 min，取250 μL于酶標(biāo)板中，使用多功能酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，測(cè)定其在570 nm的熒光強(qiáng)度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s 多重比較對(duì)均值進(jìn)行差異顯著性分析，P＜ 0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同鹽度對(duì)威氏海鏈藻細(xì)胞密度和比增長(zhǎng)率的影響

圖1可見(jiàn)，不同鹽度條件下，威氏海鏈藻8 d時(shí)各組藻細(xì)胞密度平均值達(dá)到最高，鹽度對(duì)威氏海鏈藻生長(zhǎng)影響顯著（P＜ 0.05），培養(yǎng)6 d時(shí)，鹽度25組威氏海鏈藻細(xì)胞數(shù)顯著高于鹽度5組和45組（P＜ 0.05）；培養(yǎng)8 d時(shí)，鹽度25和鹽度35組細(xì)胞密度平均值均為2.0×106mL-1，較實(shí)驗(yàn)初始密度（5×105mL-1）增長(zhǎng)4.0倍。但培養(yǎng)期間，鹽度變化對(duì)比生長(zhǎng)率影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（表1）。

圖1 不同鹽度條件下威氏海鏈藻細(xì)胞密度Fig.1 Cell density in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

表1 不同鹽度條件下威氏海鏈藻比生長(zhǎng)率Table 1 Specific growth rate of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

可見(jiàn)，鹽度25時(shí)藻細(xì)胞生長(zhǎng)最佳，鹽度5和鹽度45組生長(zhǎng)較慢，各組藻細(xì)胞密度平均值在培養(yǎng)8 d時(shí)達(dá)到最大。這與陳長(zhǎng)平等[13]對(duì)底棲硅藻新月筒柱藻（Cylindrotheca closterium）的研究結(jié)果一致。鹽度25與鹽度5、鹽度35組培養(yǎng)期間，藻細(xì)胞密度無(wú)顯著差異（P＞ 0.05），但當(dāng)鹽度變化對(duì)藻細(xì)胞形成脅迫時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度則顯著降低。當(dāng)硅藻細(xì)胞受到鹽度脅迫時(shí)，藻細(xì)胞可通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸將離子輸送出細(xì)胞膜或進(jìn)入液泡[14]，以及通過(guò)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)劑來(lái)減少鹽脅迫的影響[15]。這些細(xì)胞活動(dòng)均需耗能，因此鹽度脅迫可延緩或抑制細(xì)胞分 裂[16]。同時(shí)高鹽等不良環(huán)境易導(dǎo)致硅藻細(xì)胞產(chǎn)生一種細(xì)胞外多聚物 (Extracellular Polymeric Substances,EPS) 的黏性物質(zhì)[17]，EPS可在細(xì)胞遭遇不良環(huán)境時(shí)起保護(hù)作用，有抗失水、防止細(xì)胞硅質(zhì)壁溶解、減少滲透壓的作用，還有穩(wěn)定群落組成功能[18-19]。綜上，鹽度過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)對(duì)微藻細(xì)胞增長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，但威氏海鏈藻藻細(xì)胞有硅質(zhì)細(xì)胞壁，可在一定程度上抵抗外界滲透壓改變對(duì)藻細(xì)胞造成的影響。細(xì)胞自身有一定的滲透壓調(diào)節(jié)能力，所以在培養(yǎng)8 d時(shí)，各鹽度環(huán)境下威氏海鏈藻藻細(xì)胞密度均可達(dá)到較高水平。

2.2 不同鹽度條件下威氏海鏈藻色素含量

圖2表明，鹽度對(duì)威氏海鏈藻葉綠素a含量有顯著影響（P＜ 0.05），培養(yǎng)2～6 d期間各組葉綠素a含量均呈現(xiàn)不同程度積累，且鹽度45組葉綠素a含量顯著低于鹽度15和25組（P＜ 0.05）。鹽度15時(shí)，培養(yǎng)6 d時(shí)葉綠素a質(zhì)量濃度平均值最高，為3.4814 μg/mL，較初始值（2.2183 μg/mL）增加1.6倍，顯著高于鹽度45組。推測(cè)當(dāng)鹽度處于45時(shí)，鹽度脅迫對(duì)藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致其光合色素合成受抑制。這與余錦蘭等[20]對(duì)小新月菱形藻 (Nitzschia closteriumf.minutissima) 高鹽度脅迫響應(yīng)的研究一致。據(jù)報(bào)道，高鹽度會(huì)影響葉綠體內(nèi)囊體膜的穩(wěn)定性，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的Na+和Cl-增加，影響葉綠素和葉綠素蛋白的親和性，同時(shí)激活葉綠素酶活性，加速葉綠素分解[21]。

圖2 不同鹽度條件下威氏海鏈藻葉綠素a含量Fig.2 Chlorophyll A content in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

如圖3所示，培養(yǎng)期間各實(shí)驗(yàn)組類(lèi)胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，鹽度15組培養(yǎng)8 d時(shí)類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度平均值最高，為2.354 9 μg/mL，較初始值（1.079 3 μg/mL）增加2.2倍，顯著高于鹽度5和鹽度45組（P＜ 0.05）。類(lèi)胡蘿卜素是威氏海鏈藻的重要色素組成，可反映藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)有抗氧化作用，可清除氧化自由基。據(jù)報(bào)道，在一定范圍內(nèi)提高鹽度可增加藻類(lèi)類(lèi)胡蘿卜素的積累[22-23]。但當(dāng)鹽度過(guò)高或過(guò)低而對(duì)藻細(xì)胞形成脅迫時(shí)，類(lèi)胡蘿卜素的合成將受到明顯抑制。

圖3 不同鹽度條件下威氏海鏈藻類(lèi)胡蘿卜素含量Fig.3 Carotene content in Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

2.3 不同鹽度條件下威氏海鏈藻總糖含量

圖4可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)期間各組藻細(xì)胞可溶性總糖含量均呈先降后升的趨勢(shì)，且不同鹽度環(huán)境對(duì)藻細(xì)胞總糖積累效果有顯著影響（P＜ 0.05）。這與陳長(zhǎng)平等[13]對(duì)新月筒柱藻的研究一致。實(shí)驗(yàn)0～2 d，各組總糖含量均呈下降趨勢(shì)，推測(cè)此時(shí)藻細(xì)胞處于接種后的恢復(fù)期，需分解糖類(lèi)為細(xì)胞正常生理活動(dòng)提供能量。鹽度25組在培養(yǎng)4～6 d期間，總糖含量積累顯著優(yōu)于鹽度5和鹽度45組（P＜ 0.05）。鹽度15組培養(yǎng)8 d時(shí)總糖質(zhì)量濃度平均值最大，為123.17 μg/mL，較初始值（40.430 μg/mL）增加3.0倍。鹽度45組培養(yǎng)0～4 d總糖含量持續(xù)下降，推測(cè)是細(xì)胞處于接種后高鹽狀態(tài)，生長(zhǎng)受到抑制，需持續(xù)以糖類(lèi)為供能物質(zhì)，培養(yǎng)4 d后呈上升趨勢(shì)，藻細(xì)胞出現(xiàn)補(bǔ)償性生長(zhǎng)效應(yīng)，藻細(xì)胞可溶性總糖含量上升，且藻細(xì)胞增加糖類(lèi)合成可維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定，是藻類(lèi)應(yīng)對(duì)鹽度環(huán)境改變的一種生理調(diào)節(jié)反應(yīng)[24-25]。

2.4 不同鹽度條件下威氏海鏈藻可溶性蛋白含量

如圖5所示，鹽度35組培養(yǎng)6 d時(shí)可溶性蛋白質(zhì)量濃度顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜ 0.05），均值為142.9 μg/mL，較初始值（61.28 μg/mL）增加2.3倍，且鹽度45組可溶性蛋白含量顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組 （P＜ 0.05）。

圖4 不同鹽度條件下威氏海鏈藻類(lèi)總糖含量Fig.4 Total sugar content of Thalassiosira weissflogii under different salinity conditions

圖5 不同鹽度條件下威氏海鏈藻可溶性蛋白含量Fig.5 Soluble protein content of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

在培養(yǎng)過(guò)程中，鹽度5組可溶性蛋白含量在0～2 d時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，2～6 d時(shí)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而鹽度45組則在培養(yǎng)2～4 d時(shí)出現(xiàn)明顯下降，在4～8 d期間呈逐漸升高趨勢(shì)，推測(cè)這可能是威氏海鏈藻細(xì)胞應(yīng)對(duì)低鹽和高鹽的不同策略。當(dāng)外界鹽度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，藻細(xì)胞滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞短期大量積累脯氨酸[26]、牛磺酸[27]等滲透保護(hù)劑、硫代甜菜堿（dimethylsulfoniopropionate，DMSP）[28]等有機(jī)硫化合物以及其他氨基酸以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，抵消滲透脅迫[29-30]。研究表明，隱秘小環(huán)藻（Cyclotella cryptica）藻細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸濃度增加是緩解高滲透脅迫的主要機(jī)制[31-32]，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸積累在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒及作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)等方面有重要作用[33]，滲透脅迫可誘導(dǎo)小環(huán)藻（Cyclotella nana）甘氨酸甜菜堿和DMSP合成，且該誘導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平上均受到調(diào)控[34-35]。

2.5 不同鹽度條件下威氏海鏈藻中性脂含量

如圖6所示，實(shí)驗(yàn)期間各組中性脂含量均呈上升趨勢(shì)。鹽度5組，培養(yǎng) 2～6 d時(shí)，中性脂熒光強(qiáng)度明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜ 0.05），鹽度45組，培養(yǎng)4～8 d時(shí)中性脂的積累速度高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜ 0.05），培養(yǎng)8 d時(shí)中性脂熒光強(qiáng)度平均值達(dá)到最高，較初始熒光強(qiáng)度增加4倍，且顯著高于鹽度15和鹽度25組（P＜ 0.05）。推測(cè)鹽度45組藻細(xì)胞培養(yǎng)0～4 d時(shí)處于接種后的恢復(fù)期，細(xì)胞處于高鹽環(huán)境，增長(zhǎng)速度慢，培養(yǎng)4～8 d，細(xì)胞持續(xù)受到高鹽脅迫，中性脂積累速度加快。梁英等[36]對(duì)硅藻在不同鹽度下脂肪酸組成的研究表明，硅藻主要脂肪酸為中性脂質(zhì)，分別為16:0、16:1(n-7)和20:5(n-3)，隨著鹽度增加，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和新月菱形藻（Nitzschia closterium）單不飽和脂肪酸增加，纖細(xì)角毛藻（Chaetoceros gracilis）和細(xì)柱藻（Cylindrotheca fusiformis）單不飽和脂肪酸減少。鹽度對(duì)微藻中性脂含量有顯著影響[37]。宮鈺瑩 等[38]研究表明，高鹽環(huán)境使鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而積累中性脂肪儲(chǔ)能。魏東等[39]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度升高可顯著促進(jìn)膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea）C-169中性脂質(zhì)積累。所以，鹽度變化可導(dǎo)致藻細(xì)胞中性脂質(zhì)的積累。

圖6 不同鹽度條件下威氏海鏈藻中性脂含量Fig.6 Neutral lipid content of Thalassiosira weissflogiiunder different salinity conditions

3 結(jié)論

本研究探究威氏海鏈藻對(duì)不同鹽度環(huán)境的短期響應(yīng)。結(jié)果表明，不同鹽度對(duì)威氏海鏈藻生長(zhǎng)和生化組分有顯著影響，鹽度為15～35時(shí)，威氏海鏈藻生長(zhǎng)速度較快，生化組成較為穩(wěn)定，鹽度15時(shí)最有利于藻細(xì)胞葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素、總糖的合成，鹽度25和鹽度35時(shí)，藻細(xì)胞平均增長(zhǎng)速度較快，鹽度35時(shí)最有利于藻細(xì)胞可溶性蛋白積累。研究結(jié)果將為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)威氏海鏈藻在對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)調(diào)控方面的應(yīng)用提供參考。