李永鵬，卜晨琛，宋 霞，劉亞蓉

（青海省藥品檢驗檢測院·青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，青海 西寧 810000）

山茱萸有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫功效，臨床用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥［1］。山茱萸經(jīng)酒炮制后補(bǔ)益功能增強(qiáng)，六味地黃丸、知柏地黃丸等經(jīng)典名方均以酒萸肉為原料［2-3］，但 2015 年版《中國藥典 （一部 ）》尚未區(qū)分山萸肉和酒萸肉的質(zhì)控指標(biāo)。為了全面評價酒萸肉的質(zhì)量和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的可行性，本研究中采用超高效液相色譜（UPLC）法測定酒萸肉多指標(biāo)成分的含量，并建立指紋圖譜，為酒萸肉的臨床應(yīng)用、炮制和資源開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；BSA224SCW 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為十萬分之一）；N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化機(jī)械株式會社）；Milli-QA10 型超純水器（德國Merck Millipore 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件（北京科邁恩科技有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831-201605），5-羥甲基糠醛對照品（批號為111626-201610），莫諾苷對照品（批號為111637-201609），馬錢苷對照品（批號為111640-201707），獐牙菜苷對照品（批號為111742-200501），含量均大于98%，均購自中國食品藥品檢定研究院；山茱萸新苷對照品（上?？普苌锟萍加邢薰?，批號為Y14M10H88277，含量＞98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。山茱萸藥材均來自2019 年國家藥品評價性抽驗計劃抽驗樣品，經(jīng)青海藥品檢驗檢測院鑒定為山茱萸科植物山茱萸 Cornus officinalis Sieb.et Zucc. 的干燥成熟果肉，其中 10 批為山萸肉，76 批為酒萸肉（黃酒炮制品）。酒萸肉藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果［4-14］

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE3 C18-AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）；流動相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表 2）；流速：0.2 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷對照品各10 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容，得各單一對照品貯備液；分別取1.0 mL，置同一10 mL 容量瓶中，用80%甲醇定容，即得上述6 種成分質(zhì)量濃度分別為 24.62，35.79，59.16，9.28，43.05，18.09 μg ／mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品（編號為005）粉末（過3 號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取樣品（編號為005）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定6 次，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h，按 2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于1%（n ＝7），單峰面積占總峰面積的比例大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2%（ n ＝7），表明供試品溶液室溫下放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為005）適量，精密稱定，共 6 份，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，再按 2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以馬錢苷峰為參照峰計算。結(jié)果各特征峰相對保留時間的 RSD 小于 1% （ n ＝ 6），單峰面積占總峰面積的比例大于2%的特征峰相對峰面積的 RSD 小于2% （ n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

表1 76 批酒萸肉藥材樣品來源和指紋圖譜相似度評價Tab.1 Information about the origin of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni and their fingerprint similarity

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs of the mobile phase

2.4 指紋圖譜研究

指紋圖譜建立：取酒萸肉藥材樣品76 批，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，指紋圖譜見圖1。根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，設(shè)編號005 樣品的色譜圖為參照圖譜，其他樣品的色譜峰與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，即得酒萸肉共有模式的對照指紋圖譜，見圖2。將76 批酒萸肉藥材樣品的指紋圖譜均導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版），計算相似度，結(jié)果76 批酒萸肉藥材樣品中有60 批的相似度大于0.8，10 批的相似度小于0.7，詳見表1。結(jié)果表明，不同來源酒萸肉存在差異。

圖1 76 批酒萸肉藥材樣品超高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of 76 batches of wine-prepared Fructus Corni

特征峰標(biāo)定：根據(jù)76 批酒萸肉的特征圖譜測定結(jié)果，共標(biāo)定7 個特征峰。與對照品比對并結(jié)合圖譜可知，1 號峰為沒食子酸，2 號峰為5-羥甲基糠醛，3 號峰為莫諾苷，4 號峰為馬錢苷，5 號峰為獐牙菜苷，7 號峰為山茱萸新苷；6 號峰成分未定。

酒萸肉和山萸肉指紋圖譜比較：取10 批山萸肉藥材樣品粉末，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖3，根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，并計算酒萸肉和山萸肉指紋圖譜的相似度，結(jié)果10 批山萸肉樣品相似度分別為 0.38，0.54，0.60，0.53，0.54，0.56，0.53，0.56，0.54，0.53，詳見圖 4。結(jié)果表明，山茱萸炮制前后的指紋圖譜差異較大。

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

聚類分析：以各參照峰面積相對峰面積為變量，以Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件進(jìn)行聚類分析，采用誤差平方和法，以歐氏距離為樣品測度，聚類分析結(jié)果見圖5。結(jié)果76 批酒萸肉藥材和10 批山萸肉藥材聚為兩大類，兩大類的5-羥甲基糠醛含量差異明顯。其中有8 批山萸肉（編號分別為 077，142，214，215，249，315，333，334）與酒萸肉聚為一類，兩者相似度均小于0.7，5-羥甲基糠醛峰基本未檢出，提示炮制不到位。

圖4 酒萸肉與山萸肉藥材樣品相似度評價Fig.4 Similarity of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

圖5 酒萸肉與山萸肉藥材樣品聚類分析Fig.5 Cluster analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

圖6 酒萸肉與山萸肉藥材樣品主成分分析Fig.6 Principle component analysis of wine-prepared Fructus Corni and Fructus Corni

主成分分析：采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件將76 批酒萸肉藥材樣品和10 批山萸肉藥材樣品的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再行主成分分析（見圖6）。結(jié)果編號為 36，176，324，325，xx2 的酒萸肉藥材樣品產(chǎn)生明顯偏離，其余71 批藥材樣品基本聚集在一起。其中6 號峰（未知）對樣品36 和樣品176 偏離貢獻(xiàn)大，2 號峰（5-羥甲基糠醛）對樣品xx2、樣品324、樣品325 的偏離貢獻(xiàn)大；其余個別樣品有向2 號峰偏離，表明2 號峰對酒萸肉影響較大，與聚類分析結(jié)果相一致。

3 討論

采用二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)對對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，考察了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、甲醇-甲酸流動相系統(tǒng)不同梯度洗脫條件，對 ACE3 C18- AR 柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm），Agilent Zorbax RRHD Extend C18柱（100 mm ×2.1 mm，3 μm）進(jìn)行了優(yōu)選，篩選 0.1，0.2，0.3，0.4 mL ／ min 的流速，以及 25，30，35 ℃的柱溫，最終按選定色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，各色譜峰信息最多，各成分分離情況良好，可用于酒萸肉的指紋圖譜研究。

利用聚類分析對酒萸肉指紋圖譜進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)樣品可分為兩大類，其中48 批藥材樣品聚為一類，28 批藥材樣品聚為第二類。進(jìn)一步研究共有峰發(fā)現(xiàn)，第二類藥材樣品中5-羥甲基糠醛峰面積較大，提示5-羥甲基糠醛是聚群的主要原因，主成分分析也得到此結(jié)果。在相似度統(tǒng)計中有8 批藥材樣品相似度低于0.7，聚類分析時與山萸肉在一個大類中，提示炮制不到位。進(jìn)一步進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛對其偏離貢獻(xiàn)較大，與聚類分析結(jié)果相呼應(yīng)。5-羥甲基糠醛為山萸肉酒制后得到的新產(chǎn)物，其含量反映炮制工藝的穩(wěn)定性及優(yōu)良性，酒萸肉炮制方法為取凈山萸肉，用黃酒拌勻，待酒被吸盡后，裝罐內(nèi)密封隔水燉或置蒸器內(nèi)蒸制，用武火加熱至山萸肉色變黑潤，而5-羥甲基糠醛偏離的8 批藥材樣品顏色均未達(dá)到黑潤，原因為炮制時間不足［15］，需在酒萸肉質(zhì)量控制中加以注意。

綜上所述，該研究所建立的超高效液相色譜指紋圖譜可為酒萸肉的質(zhì)量評價提供參考。