朱金艷，于思夢，呂敬章，樸永哲，楊希國，呂日豐，陳 思，王月華，麻麗丹

（1.莊河市食品檢驗監(jiān)測中心，遼寧大連 116400；2.深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045；3.大連民族大學(xué)，生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧大連 116600；4.遼寧通正檢測有限公司，遼寧沈陽 110026；5.鳳城市匯明農(nóng)產(chǎn)品有限公司，遼寧丹東 118109；6.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866；7.丹東海關(guān)，遼寧丹東 118000）

諾如病毒（Norovirus，NoV）直徑約26～35 nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈面體對稱，電鏡下缺乏顯著的形態(tài)學(xué)特征，是引起人類病毒性胃腸炎的主要病原之一，由NoV等食源性病毒引起的食源性疾病問題日益突出，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一[1]。NoV具有很強的感染力和致病力，感染劑量低至10～100個病毒粒子，每年10月至次年3月是NoV暴發(fā)流行的高發(fā)期，極易在半封閉、人口密集的場所暴發(fā)，造成大規(guī)模群體感染，尤其易在醫(yī)院、學(xué)校、養(yǎng)老院等抵抗力弱的人群聚集地暴發(fā)，傳播途經(jīng)多樣，可經(jīng)糞-口傳播、人-人接觸、水源性以及食源性傳播[2]。

NoV在低溫下能夠存活數(shù)年，其pH耐受范圍為2～9，在60 ℃下保持30 min仍具有活性，因此食源性NoV最主要的感染源是可生食的食品。果蔬生長接近地面，易受氣候條件、土壤環(huán)境、灌溉用水及采摘人員的影響，或易腐爛、消毒清洗不徹底，具有潛在的病毒感染風(fēng)險，因此也成為除貝類以外引發(fā)NoV感染的主要食物載體。目前，國內(nèi)關(guān)于果蔬中NoV檢測標(biāo)準(zhǔn)有GB 4789.42—2016、SN/T 4784—2017和 SN/T 5325.1—2020[3-5]。GB 4789.42—2016主要檢測貝類、生食蔬菜、堅果等硬質(zhì)食品，以及草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果，硬質(zhì)食品和軟質(zhì)水果則采用不同類型NoV提取方法進(jìn)行提取，均采用實時熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測。SN/T 4784—2017的主要檢測對象為軟果、硬果、瓶裝水和貝類。SN/T5325.1—2020主要是對貝類、硬質(zhì)表面食品、生食蔬菜、軟質(zhì)水果中的食源性病毒進(jìn)行定量檢測。國際上目前通用的標(biāo)準(zhǔn)為ISO 15216-2:2019，也是主要結(jié)合食品（包括果蔬產(chǎn)品）的類型采用相應(yīng)的NoV提取方法，結(jié)合實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測[6]。為提高果蔬的安全性，提升果蔬檢測的準(zhǔn)確性和規(guī)范性，本文將對果蔬樣品中NoV的洗脫、富集和檢驗檢測方法等方面的研究現(xiàn)狀展開綜述，為果蔬中NoV的研究提供參考，防范NoV的污染和感染，保障食品安全。

1 果蔬中食源性NoV污染

1.1 果蔬中食源性NoV的污染情況

近幾十年來，全球范圍內(nèi)與果蔬相關(guān)的食源性NoV疾病暴發(fā)數(shù)量持續(xù)增長[7]。這些來源于農(nóng)產(chǎn)品中的NoV使人們在食用后患病，涉及的果蔬主要有生菜、胡蘿卜、綠蔥、草莓及藍(lán)莓等。由果蔬引發(fā)的食源性疾病在歐美國家時有暴發(fā)，2012年德國多所學(xué)校發(fā)生了由污染的草莓引起的NoV暴發(fā)，導(dǎo)致10 952人感染；同年美國生鮮果蔬產(chǎn)品食源性NoV的暴發(fā)共計287起，導(dǎo)致6 009人感染；2013年，丹麥果蔬相關(guān)的食源性NoV的暴發(fā)共計28起，導(dǎo)致655人感染[8-10]。近年來，根據(jù)大部分省市的監(jiān)測情況來看，我國由NoV引發(fā)的急性胃腸炎暴發(fā)的病例報道也逐年增加，食品作為NoV傳播載體的風(fēng)險已引起重視，食源性NoV的監(jiān)測得到風(fēng)險評估部門的重視。

1.2 果蔬中食源性NoV檢測存在的困難

文獻(xiàn)顯示，由食品引起的病毒性安全事件的實際發(fā)生數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于所報道的數(shù)量[11]。果蔬產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，富含色素、糖類和纖維素等多種成分，會造成病毒核酸提取過程中存在大量RT-PCR抑制劑，從而大大降低病毒RNA的提取效率和擴增效率，影響檢測結(jié)果。與食源性細(xì)菌相比，食源性病毒粒子的數(shù)量較少，又不可在體外繁殖，因此蔬菜中病毒的洗脫和富集處理對提高食品中病毒的檢出率和減少假陰性結(jié)果非常重要。

2 果蔬中NoV的洗脫和富集

2.1 NoV的洗脫

從水果蔬菜基質(zhì)中洗脫NoV的關(guān)鍵是打破病毒與基質(zhì)之間的靜電和疏水性作用，洗脫效果與基質(zhì)表面的形態(tài)特征（如粗糙程度等）、基質(zhì)的組成成分（如果膠、脂肪、酸堿度等）、基質(zhì)中病毒存在的部位（如內(nèi)部、外部等）、基質(zhì)的存在狀態(tài)（如冷凍、凍干等）等有關(guān)[12-13]。病毒洗脫的完整性是病毒顆粒提取的重要前提。硬質(zhì)果蔬一般采用洗脫液擦拭；軟質(zhì)水果和生食蔬菜多采用切塊方式，再通過不同種類的洗脫液進(jìn)行洗脫。

常用的洗脫液有三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸-甘氨酸-牛肉浸膏洗脫液（TGBE）、磷酸二氫鉀-氯化鈉-聚乙二醇辛基苯基醚洗脫液（Tralk）、碳酸氫鈉-大豆蛋白洗脫液（SP）等。TGBE洗脫液（0.1 mol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸、0.05 mol/L甘氨酸，3%牛肉浸膏、pH 9.5），是堿性洗脫液，其中Tris能夠保持洗脫液的緩沖能力，甘氨酸用于減少病毒對樣品成分的非特異性吸附，TGBE洗脫液使用范圍較為廣泛，為國際標(biāo)準(zhǔn)化組織的標(biāo)準(zhǔn)采用的方法。Tralk洗脫液，0.05 mol/L磷酸二氫鉀、1.0 mol/L氯化鈉、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚、pH9.2是磷酸鹽類型洗脫液的典型代表，亦屬堿性洗脫液，常被用來洗脫陰（陽）離子膜上的病毒粒子。SP洗脫液（1 mol/L碳酸氫鈉、1%大豆蛋白、pH 8.0）是以碳酸鹽為基礎(chǔ)的洗脫液，偏中性，可以在樣品表面形成氣泡，有利于病毒的洗脫，適用于表面不光滑的果蔬表面的病毒洗脫。王飛等[14]以草莓為實驗樣本，比較了3種洗脫液的洗脫效果，結(jié)果表明TGBE緩沖液洗脫草莓表面病毒粒子效果優(yōu)于Tralk洗脫液，原因可能是草莓是酸性水果，處理過程會釋放大量的酸性物質(zhì)，TGBE洗脫液pH高于Tralk洗脫液。施曉峰等[15]以新鮮藍(lán)莓、草莓、葡萄、番茄、楊梅、生菜、胡蘿卜、黃瓜為樣本，比較了7種洗脫液，TP ALK（同Tralk）洗脫液、TGBE洗脫液和磷酸緩沖鹽洗脫液（PBS）對藍(lán)莓樣品表皮感染的病毒中NoV的洗脫效果較為明顯，其中TP ALK洗脫液效果最佳，說明在藍(lán)莓表皮洗脫病毒時TP ALK成分在打破陰陽離子膜作用上強于其他洗脫液，再經(jīng)酶處理后超濾濃縮，NoV的回收率達(dá)到較高的水平。此外，管錦繡等[16]以西生菜為樣本，比較3種洗脫液，發(fā)現(xiàn)牛肉膏-甘氨酸洗脫液的洗脫效果最佳。牛肉膏-甘氨酸洗脫液含3%牛肉膏、0.05 mol/L甘氨酸、pH 9.5，在蔬菜病毒洗脫中采用較多，牛肉膏中的蛋白質(zhì)與病毒競爭吸附位點，達(dá)到洗脫的作用，甘氨酸可以改變病毒的吸附特性，在一定pH條件下，能破壞蔬菜樣品基質(zhì)與病毒顆粒之間的靜電吸附、水環(huán)境中共存的非水溶性物質(zhì)之間的相互吸附，從而可以快速、便捷地洗脫病毒粒子。另外有研究報道TGBE中所含的牛肉提取物會干擾分子生物學(xué)檢測方法，可能引起假陰性結(jié)果[17]。果蔬中含有果膠和纖維素，在洗脫液中添加果膠酶和纖維素酶可改善洗脫效果，同時消除基質(zhì)的抑制作用[18]。

2.2 NoV的富集

NoV病毒常用的富集方法有超濾法、靶向結(jié)合法、聚乙二醇（PEG）法和超離心法等[19-20]。超濾法是通過分子篩的作用使大分子病毒粒子截留在膜上而富集。靶向結(jié)合法是基于分子互作的靶向病毒富集技術(shù)，常用的靶向結(jié)合種類包括抗原-抗體結(jié)合、病毒-受體結(jié)合、篩選特異性的核酸適配體、基于噬菌體表面展示技術(shù)篩選特異性的多肽、分子印跡等[21]。PEG法具有強烈的吸水性和沉淀蛋白的作用，通過空間位置的排擠使溶液中的病毒粒子被迫聚集在一起，從而使病毒粒子沉淀富集。超離心法是利用超高的轉(zhuǎn)速使病毒顆粒在離心場中快速沉降富集。李楠等[22]比較了磁珠免疫富集法和PEG法檢測草莓中GⅡ型NoV的適用性，結(jié)果顯示磁珠免疫富集法的回收率略高于PEG法。王飛等[14]以草莓為實驗樣本，結(jié)果表明10%和15%PEG6000/NaCl的富集效果明顯好于5%PEG6000/NaCl的富集效果。張其剛等[23]以青蔥與葡萄為實驗樣本，比較豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠（PGM-MB）和PEG8000法富集檢測NoV的方法，結(jié)果表明PGM-MB法更適用于青蔥、葡萄中NoV的檢測。有研究發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)樣品，洗脫和富集的最優(yōu)方法不相同，如草莓、葡萄、生菜、洋蔥中MNV-1的最優(yōu)洗脫-濃縮方法分別是TGBE洗液-PEG沉淀組合、TGBE洗液-超濾組合、Trallk洗液-PEG沉淀組合和Trallk洗液-超濾組合[24]。Summa等[25]發(fā)現(xiàn)超離心法在萵苣和火腿中能獲得最高的NoV回收率，而PEG法從樹莓中獲得最高的NoV回收率。不同洗脫和富集方法的比較見表1。

2.3 核酸提取

洗脫富集后的病毒樣本，需要進(jìn)一步提取病毒RNA，但由于樣品基質(zhì)的不同，需要不同的處理，防止基質(zhì)成分的影響，降低抑制作用，如加入蛋白酶K、果膠酶、纖維素酶、酚-氯仿、植物RNA分離劑等[26-28]。目前也有一些根據(jù)不同產(chǎn)品定制的試劑盒，提高病毒的回收率，降低抑制率。

表1 不同病毒提取方法的比較Table 1 Comparison on different extraction methods of virus

3 果蔬中NoV的檢驗檢測方法

目前用于NoV的檢測方法主要有電鏡法、免疫學(xué)法及分子生物學(xué)法等[11]。

3.1 電鏡法

電鏡法的優(yōu)點是可以直觀地觀察到病毒顆粒，但設(shè)備價格昂貴、操作繁雜，無法廣泛普及，也不便于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)的調(diào)查研究；NoV顆粒在電鏡下檢測結(jié)果受主觀因素影響較大，檢測靈敏度低[29-30]。近年來，電鏡技術(shù)不斷發(fā)展，如膠體金免疫電鏡技術(shù)和免疫吸附電鏡技術(shù)在病毒檢測中不斷被應(yīng)用，使病毒檢測的直觀性和靈敏性大幅提高。有研究者采用膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測植物病毒，以膠體金標(biāo)記，并用電鏡觀察，結(jié)果表明該方法可以實現(xiàn)對病毒更為準(zhǔn)確可靠的檢測[31]。

3.2 免疫檢測法

免疫檢測法是利用抗原抗體反應(yīng)對病毒進(jìn)行檢測，使用的固相主要是高分子聚合物、微孔板、凝膠或硅膠等，標(biāo)記物有膠體金、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、酶、熒光標(biāo)記物等，最低檢出率一般可達(dá)105拷貝/mL[32]。研究發(fā)現(xiàn)NoV的近紅外免疫層析法與熒光RT-PCR、膠體金法相比，檢測時間短，檢測限低于膠體金法。酶聯(lián)免疫吸附測定主要針對NoV的蛋白質(zhì)外殼進(jìn)行檢測，但因病毒蛋白的變異性強，導(dǎo)致該方法敏感性、特異性較弱[33]。

總體來看，免疫法檢測NoV迅速，價格便宜，便于廣泛應(yīng)用，但由于靈敏度和特異性都欠佳，還不能完全取代分子生物學(xué)方法，僅限于初步快速篩查，仍需采用分子生物學(xué)檢測進(jìn)行再確認(rèn)。

3.3 分子生物學(xué)檢測法

NoV的分子生物學(xué)檢測方法有普通RT-PCR、實時熒光RT-PCR、微滴數(shù)字RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法、高通量測序基因芯片、多重RT-PCR、微流體RT-PCR（MF RT-PCR）等[34]。

3.3.1 普通RT-PCR和實時熒光RT-PCR

普通RT-PCR是定性檢測NoV的經(jīng)典方法，特異性和靈敏度均較高，但在電泳過程中容易出現(xiàn)非特異性擴增，造成假陽性結(jié)果。實時熒光RT-PCR技術(shù)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是在普通RT-PCR基礎(chǔ)上利用染色或探針監(jiān)測PCR反應(yīng)管中的熒光信號從而達(dá)到定量的目的，是目前國內(nèi)外檢測果蔬中NoV的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法通過設(shè)計合理的探針引物來提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性。qRT-PCR可以檢測NoV的基因型，敏感性和特異性要高于普通RT-PCR，能夠快速準(zhǔn)確定量檢測NoV[35]，但qRT-PCR無法同時檢測多種病毒。多重RT-PCR（multiplex real-time PCR，mRT-PCR）可以在一個反應(yīng)管中進(jìn)行多重病毒檢測，提高工作效率。高世光等[36]建立的MRT-PCR法，實現(xiàn)了NoV GI、NoV GII和甲肝病毒在同一反應(yīng)體系中的同時檢測，特異性為100%，對于草莓樣品中三種病毒的檢測靈敏度分別為56.2、31.6、31.4 CCID50/20 g，整個操作過程小于5 h。

3.3.2 微滴數(shù)字RT-PCR法

微滴數(shù)字PCR（droplet digital real-time PCR，ddRT-PCR）與qRT-PCR定量技術(shù)不同，對目標(biāo)病毒定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過在反應(yīng)前將體系與微滴產(chǎn)生油混合，由微滴生成儀生成上萬個液滴，每個液滴中不包含或包含一個或數(shù)個目的核酸，而每個液滴可看作一個PCR，在反應(yīng)完畢后讀取儀將讀取液滴的熒光強度與液滴數(shù)目，根據(jù)泊松分布從而進(jìn)行拷貝數(shù)定量的技術(shù)[37]。

ddRT-PCR是近年來新興的絕對定量檢測技術(shù)，又稱第三代PCR技術(shù)，此方法逐漸被國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)方法采納。研究發(fā)現(xiàn)ddRT-PCR的最低檢測限為個位，在不同濃度人工染毒生菜和西生菜樣品中，靈敏性、重復(fù)性良好，抑制物的存在對ddRT-PCR回收率沒有顯著影響[38]。有報道采用ddRT-PCR檢測萵苣和草莓中NoVI、II基因群（NoV GI和NoV GII），最低檢測濃度分別為4.68、8.47拷貝/μL，特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性均好于qRT-PCR，并有效避免假陰性[39]。

3.3.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一種直觀的核酸檢測方法，全程恒溫，其反應(yīng)液中含有大量的甜菜堿，在60～65 ℃時，DNA雙鏈處于動態(tài)平衡中，有利于引物與靶序列的結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，通過自我循環(huán)合成大量目的DNA，并產(chǎn)生白色沉淀，以渾濁度判定結(jié)果，這種檢測方法具有更高的靈敏度，且成本更低，設(shè)備簡單，可以在NoV暴發(fā)期間或在現(xiàn)場開展檢測[40]。目前該項技術(shù)已在水產(chǎn)品NoV檢測中使用，有待進(jìn)一步在果蔬產(chǎn)品中應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)在檢測牡蠣和縊蟶中的NoV方面，RT-LAMP較qRT-PCR的檢測靈敏度低10倍，且檢測低限相當(dāng)[41]。

3.3.4 高通量測序法

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）也稱為第二代基因測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），以能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志，操作包括樣品準(zhǔn)備、文庫構(gòu)建、測序反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析4個階段[42]，有別于PCR方法的擴增片段小，探針引物依賴強、感染性與非感染性不易辨別的局限性。該方法具有通量高、速度快、成本低、準(zhǔn)確性高等特點，廣泛應(yīng)用于生物的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究領(lǐng)域。

Fumian等[43]采用HTS方法在未經(jīng)處理的污水中觀察到了NoV的高遺傳多樣性，并獲得了環(huán)境樣本中循環(huán)基因型更詳細(xì)的圖像。Yang等[44]以芹菜為試驗材料，采用HTS技術(shù)檢測低拷貝的NoV，利用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行優(yōu)化，無需擴增，即可進(jìn)行文庫生成和測序，采用qRT-PCR方法對病毒RNA的分離和回收進(jìn)行確認(rèn)，成功檢測出低拷貝（<103拷貝）的病毒株或物種混合物中的NoV。

3.3.5 基因芯片檢測法

基因芯片檢測法是指將大量（通常每1 cm2點陣密度高于400）探針分子固定于支持物上，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息[45]?；蛐酒瑱z測法是一種全新的病毒檢測方法，具有高通量、高敏感性、檢測速度快等優(yōu)點。此技術(shù)中不僅有化學(xué)染料技術(shù)、激光技術(shù)，還有半導(dǎo)體微電子、分子生物學(xué)等技術(shù)，為信息科學(xué)與生命科學(xué)的深度融合建立了橋梁。

有學(xué)者采用基于磁珠的可視化基因芯片通過鏈霉親和素與生物素的親和作用，進(jìn)行核酸雜交檢測，雜交結(jié)果以肉眼或普通顯微鏡觀測NoV的存在情況，該方法便捷、靈敏性高[46]。Chung等[47]采用液相基因芯片和靜電吸附技術(shù)，快速檢測到牡蠣中的NoV，該技術(shù)尚未在果蔬產(chǎn)品中應(yīng)用。何雅青等[48]采用多重PCR擴增方法，將PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)核酸探針的微球混合物進(jìn)行雜交，利用Luminex 200液相芯片檢測儀檢測雜交結(jié)果，可同時檢測A型輪狀病毒、GⅠ型NoV和GⅡ型NoV。

4 展望

因食用感染NoV的果蔬產(chǎn)品而感染疾病已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題之一，相關(guān)報道也越來越多，有關(guān)果蔬中NoV的檢驗方法研究不斷多元化、深入化，從便利性、快捷性、準(zhǔn)確性等方面都有所突破，國內(nèi)外相關(guān)的食源性NoV檢驗標(biāo)準(zhǔn)方法也在不斷更新和改善。盡管如此，針對果蔬基質(zhì)的特殊性，尤其是諸如果蔬的沙拉等復(fù)雜基質(zhì)產(chǎn)品，加之一般屬于低劑量病毒感染，檢測方法的回收率、基質(zhì)的抑制率、檢測的質(zhì)量控制都需要進(jìn)一步創(chuàng)新研究。

果蔬的安全來源于良好的種植環(huán)境、規(guī)范的生產(chǎn)作業(yè)、標(biāo)準(zhǔn)的運輸配送，因此建立良好的全產(chǎn)業(yè)鏈果蔬追溯管理體系，做好源頭和過程的管理與監(jiān)控，是避免NoV感染的重要保障。在此基礎(chǔ)上，建立果蔬的快速檢測體系和精準(zhǔn)檢測系統(tǒng)，做到預(yù)防和監(jiān)控雙保險，能有效防止果蔬感染NoV，避免爆發(fā)病毒感染事件。