王紅梅，李劉慧

（1.莒南縣檢驗檢測中心山東臨沂 276000；2.揚州大學江蘇揚州 225000）

禽沙門氏菌病，是一個概括性術(shù)語，指由沙門氏菌屬中的任何一個或多個成員所引起禽類的一大群急性或慢性疾病。在所有動物中，最常報道的沙門氏菌來源于家禽和禽產(chǎn)品。禽沙門氏菌病是養(yǎng)禽業(yè)各個時期都值得關(guān)注的重要疾病問題。因此，定期進行沙門氏菌分離培養(yǎng)和耐藥性檢測很有必要。

1 試驗方法

1.1 細菌分離

無菌采集具有典型沙門氏菌感染病癥雞的肝臟和脾臟，將病料的新鮮截面在SS 瓊脂培養(yǎng)基的表面輕輕涂抹均勻，將涂好的培養(yǎng)基放在恒溫箱中，37℃下培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)基上選取12 個淡紅色、圓形、表面光滑、濕潤、較大、中心黑色、邊緣透明的菌落，分別接種于盛有營養(yǎng)肉湯的試管中，編號1～12 號后放在恒溫箱中，37℃下培養(yǎng)24h。

1.2 PCR試驗[1-4]

1.2.1 引物來源及設計參照沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運操縱子基因序列，此基因序列是沙門氏菌屬的高度保守序列。用軟件Prime r 5.0 設計l 對引物，長度為25b p，兩引物間核苷酸長度為234p b。引物I：5'-ACTGGC GTTATC CCTTTC TCTGCTG-3'。引物Ⅱ：5'-ATG，TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3'。預計擴增產(chǎn)物的長度為284p b。

1.2.2 擴增 取無菌 0.5mL 離心管十二支，編號1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。向每支離心管中分別加入上游引物1μL，下游引物1μL，d NTPs 4μL，10×b uffe r 5μL，水36.7μL，Ta q 酶0.3μL。然后在1～12 號離心管中各加與之對應的菌液2μL。將上述混合液稍加離心，立即置PCR 儀上，執(zhí)行擴增。在94℃預變性7min，進入循環(huán)擴增階段，94℃30s，47℃30s，72℃45s，循環(huán)30 次，最后在72℃保溫10min。反應結(jié)束，PCR 產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測。

1.2.3 電泳配置0.8%瓊脂糖凝膠，溶化后加5μLEB，倒板，取5μLpcr 擴增產(chǎn)物加1μL緩沖液上樣，點上ma rke r 后放進電泳槽，將電壓調(diào)到140 伏特，開始電泳。DNA 帶負電，電泳時向正極移動，移動至超過膠的2/3 時停止。將跑好的膠放在凝膠成像儀中成像并仔細觀察。

1.3 革蘭氏染色試驗

取出4 號和6 號試管，用接種環(huán)分別無菌沾取菌液制成涂片，進行革蘭氏染色。

將4 號試管做成的兩個玻片編號為1、2，將6 號試管做成的兩個玻片編號為3、4。將染好的玻片放在油鏡下觀察。

1.4 生化試驗

取4 號和6 號試管，用滅菌注射器將其中的純培養(yǎng)物分別接種于生化管，進行糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗、VP 試驗、枸櫞酸鹽試驗、硫化氫試驗、甲基紅試驗，以進一步鑒定細菌。

1.5 第二次PCR試驗

取無菌0.5mL離心管六支，編號1，2，3，4，5，6。向每支離心管中分別加入上游引物1μL，下游引物1μL，d NTPs 4μL，10×b uffe r 5μL，水36.7μL，Ta q 酶0.3μL。然后在1～3 號離心管中加4 號試管中的菌液各2μL，在4～6 號離心管中加6 號試管中的菌液各2μL。將上述混合液稍加離心，立即置PCR 儀上，執(zhí)行擴增。在94℃預變性7min，進入循環(huán)擴增階段，94℃30s，47℃30s，72℃45s，循環(huán)30 次，最后在72℃保溫10min。反應結(jié)束，PCR 產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測。

電泳檢測：配置0.8%瓊脂糖凝膠，溶化后加5μLEB，倒板，取5μLpcr 擴增產(chǎn)物加1μL緩沖液上樣，點上marker 后放在電泳槽里，將電壓調(diào)到140 伏特，開始電泳。DNA 帶負電，電泳時向正極移動，移動至超過膠的2/3 時停止。將跑好的膠放在凝膠成像儀中成像并仔細觀察。

1.6 藥敏試驗

用接種環(huán)在新的肉湯培養(yǎng)基中無菌挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上[5,6]。取藥敏片在平皿中央貼一片，外周等距離貼七片，貼好后置于37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)20h取出，用游標卡尺測量抑菌圈大小。用來做該試驗的藥敏紙片的名稱為：硫酸慶大霉素、頭孢唑啉鈉、諾氟沙星、青霉素鈉、乙酰螺旋霉素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗結(jié)果

2.1.1 第一次PCR 試驗的結(jié)果從圖像中可觀察到4 號和6 號有模糊成像痕跡（圖1），其他則根本沒有，因此將4 號和6 號肉湯放于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，其他的棄去?/p>

圖1 第一次PCR 的凝膠成像

圖2 四號管一

圖3 四號管二

圖4 六號管一

圖5 六號管二

2.1.2 革蘭氏染色的結(jié)果從革蘭氏染色的結(jié)果來看（圖2～5），兩個試管中的菌皆為革蘭氏陰性菌，但從菌體形態(tài)上無法判斷它們到底是不是沙門氏菌，因為沙門氏菌、大腸桿菌、志賀菌等腸道桿菌在形態(tài)上是非常相似的，而且都是革蘭氏陰性菌。因此需做生化試驗來確定。

2.1.3 生化試驗的結(jié)果由生化試驗結(jié)果（表1）可判定4 號試管內(nèi)是大腸桿菌，6 號試管內(nèi)是沙門氏菌?？稍僮鲆淮蜳CR驗證一下。

表1 生化試驗結(jié)果表

2.1.4 第二次PCR 試驗的結(jié)果從圖像中可明顯的觀察到4～6 號離心管中是沙門氏菌（圖6），1～3 號不是，即6 號試管中的純培養(yǎng)菌液是沙門氏菌菌液。用滅菌槍頭從6 號試管中吸取少量菌液接種到一個新的肉湯培養(yǎng)基中，37℃溫箱中培養(yǎng)18h，一部分用以保存菌種，一部分用于藥敏試驗。

圖6 第二次PCR 的凝膠成像

2.1.5 藥敏試驗的結(jié)果藥敏試驗的結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗結(jié)果表

2.2 討論

藥敏試驗表明沙門氏菌對硫酸慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢唑啉鈉最為敏感，其次是諾氟沙星和青霉素鈉，四環(huán)素也有一定敏感性，對乙酰螺旋霉素和羅紅霉素則表現(xiàn)為敏感不良。因此，在采用藥物治療雞沙門氏菌病過程中，養(yǎng)殖戶應把硫酸慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢唑啉鈉作為首選藥物。

耐藥性的產(chǎn)生主要是由于飼料中的抗生素含量過高和臨床上長期盲目用藥造成的[8]，由于病原菌易產(chǎn)生耐藥性，因此建議各地在治療雞細菌性腹瀉病時，要定期輪換用藥，最好先進行藥敏試驗，選出敏感藥物后再進行有效治療，避免因盲目用藥而造成的經(jīng)濟損失。當然，除了使用抗菌藥物防治該病外，還應考慮使用有效的生物制劑。近些年來微生物制劑開始在畜牧業(yè)中應用，有的生物制劑在防治畜禽下痢方面有較好效果，具有安全、無毒、不產(chǎn)生副作用，細菌不產(chǎn)生抗藥性，價廉等特點。常用的有促菌生、調(diào)痢生、乳酸菌等。在使用這類藥物的同時以及前后4～5d 應該禁用抗菌藥物。在使用時應從小群試驗開始，按照規(guī)定的劑量、方法進行，取得經(jīng)驗后再運用到生產(chǎn)中去。但是，消除該病最根本的辦法仍然是檢疫淘汰帶菌雞建立無菌雞群，消滅傳染源，切斷垂直傳播鏈鎖，從而徹底消滅雞沙門氏菌病。

3 結(jié)論

本試驗的目的在于快速篩選出對沙門氏菌敏感的藥物，用于臨床，減少盲目用藥帶來的經(jīng)濟損失。通過試驗篩選出的藥物為硫酸慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢唑啉鈉。需要注意的是這些被篩選出的藥物只是對本次疫情中的沙門氏菌敏感，如果是在不同地區(qū)不同時間，甚至同一地區(qū)不同時間再次發(fā)生沙門氏菌疫情時，這些藥物就不一定敏感了，需要再做分離和藥物篩選來確定哪些藥物敏感。