張鐵凝 李 全 巴 特 邵天喜 李 芳 王凌峰

(1 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，包頭市 014060，電子郵箱：btyxyztn@163.com；2 內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院燒傷外科，包頭市 014010)

慢性難愈創(chuàng)面是指各種原因形成的經(jīng)1個(gè)月以上治療未愈合也無明顯愈合傾向的創(chuàng)面[1]。隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口老齡化以及人民生活方式的改變，慢性疾病譜也發(fā)生了變化，慢性難愈創(chuàng)面的發(fā)病率逐漸增高。目前，治療慢性難愈創(chuàng)面的主要方法有手術(shù)治療、換藥、負(fù)壓引流等，但這些方法治療時(shí)間長，治療費(fèi)用高，而且效果不佳[2-3]。富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)作為組織工程研究的熱點(diǎn)，為慢性難愈創(chuàng)面的治療提供了新的思路。本研究從慢性難愈人創(chuàng)面肉芽組織中分離出成纖維細(xì)胞，觀察并比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為，為PRP治療慢性難愈創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 標(biāo)本來源、主要儀器及試劑

1.1.1 標(biāo)本來源：收集在內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院慢性創(chuàng)面診療管理中心行慢性創(chuàng)面清創(chuàng)術(shù)的患者術(shù)后廢棄的肉芽組織，并抽取患者靜脈血50 mL。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡18～65歲；(2)創(chuàng)面超過1個(gè)月未愈合，最近2周創(chuàng)面未見明顯縮??；(3)創(chuàng)面處于非急性感染期(如創(chuàng)面局部出現(xiàn)明顯的紅腫熱痛，或較多膿性分泌物，或明顯異味)；(4)各種原因?qū)е碌钠つw全層缺損，如Ⅲ度燒傷、嚴(yán)重毀損傷。上述標(biāo)本取樣均獲得患者同意并且簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器：醫(yī)用離心機(jī)和PRP制備用套裝購自山東威高醫(yī)療器械有限公司(魯威械備20150044)；海藻酸鈉、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、無水氯化鈣、人膠原酶Ⅰ型酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自Sigma 公司(試劑盒批號(hào)分別為：W201502、SCR103、59418C、C1016、CC050)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司(試劑盒批號(hào)分別為：A4192101、12664025)。

1.1.3 PRP及水凝膠的制備：采用PRP制備用套裝制備PRP，采集全血，室溫下4 000 r/min離心20 min后棄去最下層紅細(xì)胞，再進(jìn)行第2次離心(室溫下4 000 r/min離心30 min)，中間棕黃色層即為PRP，見圖1。水凝膠參考文獻(xiàn)[4]制備。

圖1 PRP的制備過程

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo)

1.2.1 成纖維細(xì)胞的分離和鑒定：收集患者慢性創(chuàng)面的肉芽組織，無菌條件下用含雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(購自Sigma公司)充分洗滌去污染，剪成約2 mm×2 mm小塊，用含雙抗的PBS洗滌3次，剪碎至糊狀，轉(zhuǎn)移至含0.1% Ⅰ型膠原酶(1 ∶2)離心管中，37℃水浴恒溫?fù)u床振蕩消化2 h。在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞后，加入等體積的含胎牛血清的DMEM液終止消化。收集細(xì)胞濾液，1 500 r/min離心10 min,棄上清，用含胎牛血清的DMEM重懸，收集細(xì)胞,以1×105個(gè)/mL的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，原代細(xì)胞生長融合近100%時(shí),棄培養(yǎng)液,加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化，棄消化液，加入-乙二胺四乙酸,輕吹打貼壁細(xì)胞成單細(xì)胞,以1 ∶2的比例傳代接種,20 h后細(xì)胞鋪滿瓶底，繼續(xù)傳代培養(yǎng)細(xì)胞至第3代，顯微鏡觀察細(xì)胞大體形態(tài)，通過免疫組織化學(xué)染色檢測波形蛋白(波形蛋白抗體購自英國Abcam公司，批號(hào)：ab92547)對成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2 成纖維細(xì)胞生長曲線測定：取第3代成纖維細(xì)胞，分為胎牛血清組、水凝膠組和PRP組，分別用含胎牛血清、水凝膠、PRP的DMEM連續(xù)培養(yǎng)8 d，每組細(xì)胞的濃度均為103個(gè)細(xì)胞/孔，每天從各組培養(yǎng)基中取少量培養(yǎng)物，分別用結(jié)晶紫染色后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每天每組細(xì)胞計(jì)數(shù)3次后取平均值，繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取第3代成纖維細(xì)胞,分為胎牛血清組和PRP組，分別接種于12孔板中培養(yǎng)(細(xì)胞的濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，細(xì)胞長滿后，參考文獻(xiàn)[5]用200 μL移液管尖端在培養(yǎng)板底層人為劃痕，觀察細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)24 h、48 h、72 h后的融合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。水凝膠組未做細(xì)胞遷移試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成纖維細(xì)胞的形態(tài)和鑒定結(jié)果 分離的細(xì)胞剛貼壁時(shí)，細(xì)胞呈短梭形或不規(guī)則形，傳代后細(xì)胞形態(tài)均一，排列規(guī)則。細(xì)胞密度低時(shí)細(xì)胞排列疏松；密度高時(shí)細(xì)胞排列呈平行狀或漩渦狀。胞體狹長、透亮，胞漿豐富，胞核清晰呈卵圓形，居中，偶見雙核。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞核呈淡紫色，提示所獲得的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，見圖2。

圖2 人創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 3組成纖維細(xì)胞的增殖情況 3組成纖維細(xì)胞均生長良好，培養(yǎng)的第2天，細(xì)胞生長速度開始增快，第3～5天細(xì)胞增殖活躍。胎牛血清組細(xì)胞于培養(yǎng)的第5天生長達(dá)頂峰，第6～8天生長速度減慢；水凝膠組細(xì)胞于培養(yǎng)的第6天生長達(dá)頂峰，第7～8天生長速度減慢；PRP組細(xì)胞持續(xù)增殖，見圖3。培養(yǎng)第5、6、7、8天，PRP組細(xì)胞數(shù)量多于胎牛血清組和水凝膠組，第6、8天水凝膠組細(xì)胞數(shù)量多于胎牛血清組(均P<0.05)，其他培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)3組細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

圖3 不同培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞的生長曲線

表1 3組成纖維細(xì)胞的增殖情況的比較(x±s，×104個(gè))

2.3 兩組成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移面積的比較 劃痕實(shí)驗(yàn)24 h時(shí)，PRP組成纖維細(xì)胞遷移面積與胎牛血清組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；劃痕實(shí)驗(yàn)第48 h、72 h，PRP組成纖維細(xì)胞劃痕遷移面積均大于胎牛血清組(均P<0.05),見表2和圖4。

表2 兩組成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移面積的比較(x±s，%)

圖4 成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×50)

3 討 論

成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞，其生理功能受到抑制后[2-3]，可影響創(chuàng)面的正常愈合，甚至導(dǎo)致慢性難愈創(chuàng)面的形成。如何恢復(fù)成纖維細(xì)胞的正常生理功能成為治療慢性難愈創(chuàng)面的新思路。以往針對成纖維細(xì)胞的研究多采用正常皮膚組織或瘢痕組織作為標(biāo)本，雖然取材方便，但并不能反映慢性創(chuàng)面皮膚組織的特點(diǎn)。本研究直接收集慢性難愈創(chuàng)面肉芽組織，成功分離出成纖維細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

喇文軍等[6]發(fā)現(xiàn)胎牛血清可以體外促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖，也有研究顯示PRP可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長和遷移[7-9]。PRP是從血液提取的血小板濃縮物，研究已證明[3，7-11]PRP中含有成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等多種生長因子。而PRP中的生長因子均可促進(jìn)創(chuàng)面愈合[12-14]。目前，PRP已在整形外科、骨科等科室中得到廣泛應(yīng)用[10,15]。為探討PRP對慢性難愈創(chuàng)面的治療作用，本研究分別采用含胎牛血清、水凝膠和PRP的培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長遷移情況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)第5天起，PRP組的成纖維細(xì)胞數(shù)量多于其他兩組，劃痕實(shí)驗(yàn)第48 h、72 h，PRP組細(xì)胞劃痕遷移面積均大于胎牛血清組(均P<0.05)，提示與胎牛血清相比，PRP可更好地促進(jìn)人創(chuàng)面肉芽組織成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，與Cho等[7-9]的研究結(jié)果相似。其原因可能是PRP中的血漿為血小板和成纖維細(xì)胞提供了部分營養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)、激素和生長因子，調(diào)節(jié)血小板和細(xì)胞的生理活動(dòng)，同時(shí)血小板可持續(xù)緩慢釋放各類生長因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖。這表明PRP或可通過影響創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的生長和遷移，對創(chuàng)面愈合起促進(jìn)作用，這為PRP治療慢性難愈創(chuàng)面提供了新的思路。

本研究采用PRP制備用套裝二次離心法制備PRP，制備過程無須中途更換離心管，減少了血小板的激活和污染，同時(shí)保留了部分的血漿成分。同時(shí)，與傳統(tǒng)組織工程材料相比，PRP可以采用自體血液制備[11]，操作相對簡單，同時(shí)降低了異體或異種材料潛在的生物風(fēng)險(xiǎn)，也減輕了患者的負(fù)擔(dān)，這為PRP的臨床應(yīng)用提供了方便。但臨床上應(yīng)用PRP治療創(chuàng)面時(shí)還需考慮以下問題：(1)一次制備的PRP數(shù)量通常不足以用于整個(gè)治療過程，如何有效地延長PRP體外保存時(shí)間，避免多次采血制備，從而減輕患者痛苦；(2)PRP能否聯(lián)合抗生素應(yīng)用于創(chuàng)面，如何聯(lián)合，是否會(huì)影響PRP的效應(yīng)；(3)PRP的使用是否有創(chuàng)面過度增生形成瘢痕的風(fēng)險(xiǎn)。這些問題都需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，與胎牛血清相比，采用PRP培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞能更有效地促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，這為PRP臨床治療慢性難愈創(chuàng)面提供新的理論依據(jù)。