佟盼盼，張 磊，宋小珍，任美靈，賈陳陽，帕麗旦·努爾蘭，譚美玲，況 玲，謝金鑫

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

在馬屬動物中迄今已鑒定出9種皰疹病毒(Equid herpesvirus，EHV)，即EHV-1～EHV-9，其中EHV-1、-3、-4、-6、-8、-9屬于α-皰疹病毒亞科，EHV-2、-5、-7屬于γ-皰疹病毒亞科[1]。馬是EHV-1、-2、-3、-4、-5的自然宿主[1]。EHV-5可導(dǎo)致馬呼吸道疾病，表現(xiàn)為咽炎、有鼻和眼分泌物、呼吸急促、咳嗽、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、食欲減退等，呈地方性散發(fā)感染，在患馬的鼻腔分泌物、外周血單核細(xì)胞以及淋巴器官中可檢測到該病毒[2-7]。近年來已有多個國家和地區(qū)報道了EHV-5在馬上的流行情況，但對該病毒的發(fā)病機制了解較少，缺乏對該病毒引起疾病的有效治療方法[2-7]。我國對EHVs研究僅限于EHV-1和EHV-8[8-9]，尚缺少對EHV-5流行現(xiàn)狀的報道及相應(yīng)的檢測方法。

gH糖蛋白的分子質(zhì)量大小約55 ku，由498個氨基酸的多肽組成，共有11個糖基化的潛在位點與其N端連接，目前是病毒融合蛋白中唯一呈現(xiàn)出經(jīng)典結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體是EHV-5中具有重要意義的囊膜蛋白[10]。本研究首次在國內(nèi)馬匹鼻拭子樣品中檢測到EHV-5，并對病毒gH基因進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析，可為EHV-5的流行病學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 本實驗室于2018年從新疆烏魯木齊某馬術(shù)俱樂部采集226匹臨床健康純血馬鼻拭子樣品。

1.1.2 主要試劑 Viral Nucleic Acid Extraction Kit，旭基生物科技有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、Reverse Transcriptase M-MLV、Klenow Fragment、Ribonuclease H、ExTaq，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2.3 主要儀器設(shè)備 普通PCR儀和5415 R冷凍型離心機，Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；OptimaTMMAX-TL臺式超速離心機，Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 宏病毒組學(xué)分析 參考本實驗室建立的宏病毒組學(xué)樣品處理方法[11]，對馬呼吸道樣品進(jìn)行處理。將隨機擴增獲得的DNA通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化，合格后送上海派森諾生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行高通量測序(Illumina HiSeq X-ten)。

1.2.2 引物 參照GenBank中EHV-5參考毒株(登錄號：KM924295)gH基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計gH基因特異性引物，上游：5′-CAAGATGGTGGAGTTTGAGGTTACT-3′；下游：5′-GTTAGAAACCAGCTTGCTTTCAGAG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR體系及程序 按照Geneaid試劑盒說明書的步驟，提取馬鼻拭子的病毒DNA。以馬鼻拭子病毒DNA為模板，擴增gH基因，體系如下：ExTaq0.125 μL，dNTPs 0.8 μL，10×ExTaqbuffer 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補齊至25 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，共34個循環(huán)；72℃終末延伸10 min。通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測特征性條帶，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.2.4 gH基因的同源性及其氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)GenBank中登錄的相關(guān)EHV-5 gH序列，采用DNAstar軟件對獲得的EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列與EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法構(gòu)建gH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，步展值重復(fù)1 000次進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1 宏病毒組學(xué)分析

宏病毒組學(xué)分析共產(chǎn)生73 664 946條reads，有16 067條reads (0.022%)注釋為哺乳動物病毒(皰疹病毒、副流感病毒、痘病毒、細(xì)小病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和小雙節(jié)RNA病毒等16個病毒科)，其中有105條reads注釋到EHV-5 gH基因，核苷酸同源性為96.8%～100%，讀長150 nt。

2.2 PCR檢測結(jié)果及gH基因序列測定

通過特異性PCR檢測，在226份鼻拭子樣品中有14份顯EHV-5陽性，陽性率為6.2%(14/226)，部分純血馬鼻拭子樣品EHV-5 gH基因的PCR擴增結(jié)果見圖1；14株病毒gH基因核苷酸序列提交至GenBank，獲得登錄號為MT547931-MT547944。

2.3 gH基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析

用MegAlign軟件將本研究鑒定的14株EHV-5(9817、HB、9060、7917、7691、7689、1003、1364、4445、7446、7448、7683、1482和1495株)gH基因的核苷酸和氨基酸序列與GenBank登錄的5條EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，14株gH基因核苷酸和氨基酸序列與澳大利亞(EHV-5.2-141和2-141/67株)、意大利(glycoprotein H株)及日本(16-I-1064和1-I-790株)的EHV-5 gH基因核苷酸和氨基酸同源性為98.4%～100%和90.3%～100%(表1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～5、7～8、10～12.陽性樣品; 6、9.陰性樣品

2.4 EHV-5 gH氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹分析

以上述5株EHV-5為參考株，用MEGA7.0.26軟件構(gòu)建gH氨基酸序列進(jìn)化樹,結(jié)果14株我國EHV-5 gH基因與澳大利亞2-141/67和EHV-5.2-141參考株處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近，但與意大利的glycoprotein H株和日本16-I-1064和1-I-790株處于不同分支(圖2)。

3 討論

宏病毒組學(xué)能夠克服傳統(tǒng)實驗室檢測方法的局限性，實現(xiàn)病原的高精度識別，其依托高通量測序，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出樣品中所有的病毒組成，在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒溯源、傳染病和流行病學(xué)預(yù)警等研究方面具有重要作用[12]。本研究將宏病毒組學(xué)方法用于烏魯木齊市純血馬呼吸道樣品攜帶病毒多樣性研究，首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了EHV-5，表明該病毒存在于國內(nèi)馬群中。

EHV-5感染引起的呼吸道疾病嚴(yán)重危害全世界馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究顯示烏魯木齊市某馬場純血馬EHV-5陽性率為6.2%(14/226)，在全球馬匹EHV-5陽性率(2.3%～74%)的范圍內(nèi)[2-7]，提示還需要擴大調(diào)查范圍，進(jìn)而掌握新疆地區(qū)EHV-5流行趨勢和特征。

本研究鑒定的14株EHV-5 gH基因的核苷酸同源性為98.2%～100%，氨基酸同源性為95.3%～100%，表明烏魯木齊市馬場EHV-5為低變異毒株。已有報道顯示多數(shù)情況下鼻拭子樣品中能同時檢測到EHV-5和EHV-2[2-7]。本研究在226匹純血馬鼻拭子樣品中未檢測到EHV-2，表明該馬術(shù)俱樂部純血馬為EHV-5單一感染。

表1EHV-5的核苷酸(右上)和氨基酸(左下)同源(%)

●代表本研究發(fā)現(xiàn)的毒株。

為了更好地改良本土馬匹品種，近幾年我國從澳大利亞、愛爾蘭、日本等多個國家引進(jìn)純血馬。我國海關(guān)對進(jìn)口馬的檢測項有EHV-1、非洲馬瘟病毒等[13]，但目前并未將EHV-5檢測納入其中。本研究中純血馬馬術(shù)俱樂部無本土馬飼養(yǎng)史,研究結(jié)果提示純血馬在入境、疆內(nèi)運輸和入場前需要酌情考慮增加EHV-5檢測項，以防范EHV-5在我國馬群中擴散，規(guī)避EHV-5感染引起的經(jīng)濟損失。