王旭蕾，胡 月，加爾肯，車傳忠，劉建華，鄭學(xué)功，王雪竹，冉多良

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

馬鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis，ER)是馬屬動物的發(fā)熱性急性傳染病的總稱。引發(fā)該病的病原體主要是馬皰疹病毒1型(EHV-1)和馬皰疹病毒4型(EHV-4)[1-2]。EHV-1是一種引起馬匹不同臨床綜合征的病原體，具有高度傳染性，主要引起呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，母畜流產(chǎn)和新生兒死亡[3-4]。近年來，新疆的馬產(chǎn)業(yè)在不斷地發(fā)展，據(jù)2014年-2017年新疆地區(qū)的調(diào)查顯示，ER在新疆廣泛流行，嚴(yán)重制約著新疆養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展。EHV-1引起的疾病發(fā)病率和病死率較高，但卻沒有針對EHV-1的血清學(xué)檢測方法[5-11]，對EHV-1的防控工作帶來巨大的困難。gG基因部分氨基酸的同源性低可區(qū)分EHV-1和EHV-4[12-13]，由于兩種病毒之間廣泛的免疫交叉反應(yīng)[14]，在實(shí)驗室常規(guī)檢測中，無法從血清學(xué)角度區(qū)分[1]。目前國外已有商品化的EHV-1/4的ELISA抗體分型試劑盒，但價格昂貴，不適用于大量檢測血清樣本，而國內(nèi)沒有類似的試劑盒[12-15]。因此，需要建立一種價格低廉、快速、敏感且能大量檢測血清樣本的EHV-1抗體的方法。

本試驗旨在對已獲得的EHV-1gG基因的181-343位氨基酸表達(dá)的蛋白作為包被抗原，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測EHV-1抗體的間接ELISA方法，為新疆EHV-1的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和血清 含有pGEX-4T-1-gG重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株，EHV-1陽性、陰性血清，EHV-4 陽性血清，馬流感病毒(EIV)陽性血清，馬動脈炎病毒(EAV)陽性血清均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TMB顯色液和DAB試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；EHV-1/4型抗體分型試劑盒，西班牙英吉納(Ingenasa)公司產(chǎn)品；兔抗馬IgG-HRP，Abcam公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 ELISA酶標(biāo)板，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，Biorad公司產(chǎn)品；4℃離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；垂直潔凈工作臺(SW-CJ-2F)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；37℃生化培養(yǎng)箱，寧波萊?？萍加邢薰井a(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的表達(dá)及鑒定 將含有pGEX-4T-1-gG重組質(zhì)粒的大腸埃希氏菌采用進(jìn)行培養(yǎng)，將菌體重懸后進(jìn)行超聲波破碎并用GSTrapTMHP kits進(jìn)行純化。對純化后的gG蛋白進(jìn)行Western blot驗證。

1.2.2 間接ELISA方法的建立

1.2.2.1 重組抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋度 采用方陣滴定法將純化的抗原稀釋為1、0.5、0.25、0.25 μg/mL共4個包被濃度，EHV-1 陽、陰性血清稀釋成1∶50～1∶1600共8個稀釋濃度。根據(jù)常規(guī)間接ELISA方法進(jìn)行試驗，根據(jù)陽性血清與陰性血清P/N值最大時，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

1.2.2.2 最佳包被及封閉條件 用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.05 mol/L Tris 緩沖液和0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，分別在4℃下過夜包被，在37℃下包被2 h和室溫包被2 h，通過P/N值最大組的反應(yīng)條件確定最佳包被條件。取10 g/L和50 g/L脫脂乳、10 g/L和50 g/L BSA作為封閉液，37℃封閉0.5、1、1.5、2 h，通過P/N值最大組的反應(yīng)條件確定最佳封閉條件。

1.2.2.3 最佳酶標(biāo)二抗及顯色條件 將酶標(biāo)二抗按照說明進(jìn)行1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000稀釋，37℃反應(yīng)0.5、1、1.5、2 h，通過P/N最大組的反應(yīng)條件確定酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間。將底物溶液加入酶標(biāo)板后，37℃反應(yīng)5、10、15、20 min，通過P/N最大組的反應(yīng)條件確定底物最佳反應(yīng)時間。

1.2.3 特異性和敏感性試驗 取EHV-4、馬流感病毒(EIV)和馬動脈炎病毒(EAV)陽性血清各1份，按照間接ELISA優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性試驗。按照間接ELISA優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件，檢測8個倍比稀釋后的馬鼻肺炎陽性血清，進(jìn)行敏感性試驗。

1.2.4 重復(fù)性試驗 用同批次的酶標(biāo)板和不同批次的3塊酶標(biāo)板分別包被抗原，對9份馬鼻肺炎陽性血清進(jìn)行檢測，每份血清做6次重復(fù)，按照已優(yōu)化的ELISA最佳反應(yīng)條件進(jìn)行操作，對結(jié)果計算變異系數(shù)，評價方法的組內(nèi)重復(fù)性、組間重復(fù)性。

1.2.5 與商品化試劑盒對比 用已優(yōu)化的間接ELISA最佳反應(yīng)條件，與國外商品化馬皰疹病毒1/4型抗體分型試劑盒同時檢測316份馬血清，將結(jié)果進(jìn)行對比并計算符合率，比較兩者之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的Western blot分析

37℃條件下誘導(dǎo)重組菌pGEX-4T-1-gG，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)的目的蛋白約為42 ku。利用GSTrapTMHP kits純化重組蛋白并進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果表明，gG重組蛋白能與EHV-1陽性血清發(fā)生良好的特異性反應(yīng)，出現(xiàn)大小約為42 ku的條帶，而與EHV-4陽性血清無特異性條帶(圖1)。表明重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白具有良好的特異性和免疫原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.EHV-1陽性血清; 2.EHV-4陽性血清

2.2 馬皰疹病毒1型間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的確定

2.2.1 抗原最佳包被濃度及血清最佳稀釋度的確定 通過方陣滴定法，按照常規(guī)間接ELISA各反應(yīng)條件進(jìn)行操作，當(dāng)抗原蛋白最佳包被濃度為0.5 μg/mL，一抗最佳稀釋度為1∶800時，P/N值最大(表1)。

2.2.2 最佳包被和封閉條件的確定 以0.05 mol/L PBS作為包被液，4℃過夜時，P/N值最大；最佳封閉條件以50 g/L脫脂乳為封閉液，37℃封閉1 h時，P/N值最大。

2.2.3 最佳酶標(biāo)二抗及顯色條件的確定 酶標(biāo)二抗工作濃度為1∶10 000，37℃孵育30 min時，P/N值最大；顯色時間為10 min時，P/N值最大。

2.3 特異性和敏感性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，除了EHV-1陽性血清顯示為陽性，其他陽性血清均為陰性，說明gG蛋白具有良好的特異性，能區(qū)分EHV-1和EHV-4，不與EIV、EAV及EHV-4發(fā)生交叉反應(yīng)。試驗結(jié)果顯示，陽性血清稀釋1∶1 600后，仍可以檢測到陽性，說明建立的間接ELISA方法具有良好的敏感性。

表1抗原最佳包被濃度與血清稀釋度的確定

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

結(jié)果計算可得，組內(nèi)變異系數(shù)與組間變異系數(shù)均小于5%(表2)，說明已建立的間接ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表2組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5 與商品化試劑盒進(jìn)行比較

按照間接ELISA的最佳反應(yīng)條件與瑞典Svanova公司的馬皰疹病毒1/4型抗體分型試劑盒檢測316份樣品，兩種方法的復(fù)合率為93.35%(295/316)(表3)。

表3間接ELISA檢測方法的應(yīng)用

3 討論

自1981年發(fā)現(xiàn)EHV-1和EHV-4以來，流行病學(xué)調(diào)查顯示該病在全球范圍內(nèi)廣泛存在[15]。我國馬鼻肺炎流行病學(xué)現(xiàn)狀結(jié)果顯示，該病在新疆呈現(xiàn)地區(qū)特異性，隨著新疆養(yǎng)馬業(yè)的快速發(fā)展，該病的防控工作不容忽視[6]。有研究建立的馬皰疹病毒抗體間接ELISA方法，從血清學(xué)角度檢測EHV-1和EHV-4，但無法區(qū)分兩者[18]。對ER的流行現(xiàn)狀調(diào)查顯示，ER在世界范圍內(nèi)廣泛存在并帶來巨大的損失，而有關(guān)EHV-1引起疾病的發(fā)病率和病死率出現(xiàn)上升趨勢，但尚無關(guān)于EHV-1的流行病學(xué)調(diào)查詳細(xì)資料[6]。

本研究利用已成功表達(dá)EHV-1 gG的重組特異性蛋白，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了EHV-1抗體間接ELISA方法。結(jié)果顯示，本試驗建立的方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，與國外試劑盒的符合率較高。以上試驗說明本研究建立的EHV-1抗體間接ELISA檢測方法顯示出良好的應(yīng)用前景，為后期開發(fā)商品化試劑盒奠定基礎(chǔ)，也為疫苗后期的免疫效果評價提供依據(jù)，對EHV-1的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查及防控工作起到技術(shù)支撐作用。