鄧 靜，王 喜，衛(wèi)朝輝，趙維薇，單春蘭，張 博，萬 全，趙 汝，高利波，高 洪*

(1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201；2.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201；3.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201)

耶爾森強毒力島(high pathogenicity island，HPI)主要含有與鐵攝取功能有關的毒力基因簇，irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-fyuA(irp2-fyuA)基因簇位于HPI核心功能區(qū)，是參與合成鐵載體耶爾森菌素的主要基因成分，已證實HPI廣泛散布于腸道致病菌中[1]。大腸埃希氏菌(E.coli)常導致仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病等疾病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害十分嚴重[2]。比較HPI陽性與陰性E.coli致病性差異，發(fā)現HPI可顯著增強致病性E.coli的毒性[3]。此外，HPI能在E.coli中發(fā)生水平轉移，在E.coli的致病機制中起著重要作用[4-5]。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是動物機體固有免疫系統的感受器，可激活下游髓樣分化因子(myeloid differentiation factor,MyD88)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路，誘導相關細胞因子釋放，參與炎性或免疫性疾病進展[6]。泛素蛋白酶體(ubiquitin-proteasome system，UPS)是細胞內蛋白質降解的主要途徑，對目的蛋白具有高度的特異性和選擇性，該降解途徑在細胞內參與蛋白質量控制、細胞周期調控、信號轉導、抗原呈遞等生物學過程[7]。泛素蛋白酶體能夠活化NF-κB，參與多種免疫反應的調控。TLR4/NF-κB信號通路的活化，可促進細胞內炎性腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1(interleuk-1，IL-1)等炎癥介質的產生[8]。E.coli的內毒素(lipopolysaccharide，LPS)在機體內能通過活化TLR4，降解IκB來解除對NF-κB的抑制,而后進入核內促進炎性細胞因子包括TNF-ɑ、IL-1的轉錄,進一步促進NF-κB的活化,形成局部炎癥擴大的級聯效應[9]。泛素(Ub)和E.coliHPI的存在均能調控TLR4的表達，其中Ub起主要作用并能影響E.coliHPI的作用機制[10]；且E.coliHPI可通過泛素化途徑上調IκB-α的表達，促進TNF-α和IL-1的釋放。然而，E.coliHPI是否能夠通過泛素蛋白酶體激活其介導的TLR4/NF-κB信號通路目前尚不明確。

本研究用撒壩豬源E.coliHPI陽性和陰性菌株分別感染正常的IPEC-J2細胞和經泛素蛋白酶體抑制劑MG-132處理的IPEC-J2細胞。以試劑盒檢測泛素蛋白酶體活性，熒光定量PCR方法檢測泛素蛋白酶體介導的TLR4/NF-κB信號通路中關鍵因子TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α 的mRNA水平，ELISA檢測NF-κB、IκB-α及炎性因子IL-1和TNF-α的含量。通過TLR4/NF-κB信號通路中上述關鍵因子及炎性因子的變化，闡明泛素蛋白酶體介導的撒壩豬源E.coliHPI誘發(fā)炎癥反應的作用機制，并為尋找E.coli相關疾病的治療靶點提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與菌株 豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)，購自廣州吉尼歐生物有限公司；撒壩豬源E.coliHPI陽性菌株和E.coliHPI陰性菌株來源于云南省楚雄州祿豐縣撒壩豬豬場，由云南農業(yè)大學動物病理實驗室所鑒定保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和噻唑藍(MTT)，Sigma公司產品；細胞蛋白酶體抑制劑(MG-132)，上海碧云天生物技術有限公司產品;RNAios Plus提取試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR Premix ExTaqTMII，寶生物工程(大連)有限公司產品;5×All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒，愛必夢生物有限公司產品；細胞20S蛋白酶體活性檢測試劑盒,賽捷生物科技有限公司產品；porcine NF-κB、IκB-α、IL-1、TNF-α的ELISA檢測試劑盒，賽捷生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 Beckman低溫超速離心機,美國貝克曼庫爾特有限公司產品;倒置熒光顯微鏡,Olympus公司產品;CO2培養(yǎng)箱,美國Thermo scientific公司產品;CFX熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司產品;酶標儀,Bio Tec公司產品。

1.1.4 引物 采用Primer Premier 6.0設計熒光定量PCR引物(表1)。

1.2 方法

1.2.1 細胞、菌株培養(yǎng) 采用DMEM/High Glucose培養(yǎng)液，將IPEC-J2細胞置于37℃、體積分數為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取E.coliHPI陽性株和陰性株分別接種于LB瓊脂固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至其活化使細菌恢復至正常生長狀態(tài)。挑取活化后的單個細菌菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。取OD 600nm=0.6～0.8之間的E.coli菌液制成DMEM/High Glucose培養(yǎng)基重懸菌液感染IPEC-J2細胞(每2 mL細胞培養(yǎng)液中加入100 μL重懸菌液)。以培養(yǎng)的正常IPEC-J2細胞為空白對照組，取對數生長期細胞隨機分成HPI陽性株感染組(HPI+組)、HPI陰性株感染組(HPI-組)、HPI陽性株+MG-132組(HPI++MG-132組)、HPI陰性株+MG-132組(HPI-+MG-132組)。每組設置3個重復，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組分別于感染后4、6、12、24 h收集IPEC-J2細胞及其上清液用于泛素蛋白酶體活性、熒光定量PCR及ELISA的檢測。

1.2.2 MTT細胞毒性試驗 收集細胞并調整濃度至1×104個/孔的量，接入96孔細胞培養(yǎng)板中，IPEC-J2細胞并調整濃度至2×105/孔的細胞密度接種于6孔板分別加入等量1、2.5、5、10、20 μmol/L的MG-132溶液培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液，孵育4 h棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)并振蕩充分溶解，于490 nm處檢測其OD值，并計算細胞存活率，選擇MG-132藥物的最佳工作液濃度，使細胞活性不低于80%。

1.2.3 蛋白活性檢測 采用細胞20S蛋白酶體活性檢測試劑盒測定樣本中的泛素蛋白酶體活性。

1.2.4 熒光定量PCR Trizol法提取細胞總RNA，4℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清液后至通風櫥中干燥，將總RNA溶于適量預冷DEPC水中，測定濃度后反轉錄為cDNA。熒光定量PCR方法檢測TLR4、MyD88和IκB-α mRNA表達水平并以β-actin為內參基因進行校正。反應體系：SYBR Premix ExTaqII(Tli rnaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，Template(<100 ng) 2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。

1.2.5 ELISA檢測 應用ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中NF-κB、IκB-α、IL-1和TNF-α的蛋白含量，以NF-κB、IκB-α、IL-1和TNF-α的標準曲線計算上述4種因子在各組不同時間點的蛋白濃度。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 23.0數據分析軟件，符合正態(tài)分布的計量資料平均數±標準差表示。用單因素方差分析(LSD法)比較各組均數差異顯著性，以GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結果

2.1 泛素蛋白酶體活性水平測定結果

本研究中IPEC-J2細胞所用MG-132藥物的最適工作濃度為10 μmol/L。與空白對照組相比，HPI+組中泛素蛋白酶體活性水平均呈升高趨勢，HPI+組始終高于HPI-組，且在感染后6 h～24 h，兩組差異極顯著(P<0.01)；HPI++MG-132組與HPI-+MG-132組中泛素蛋白酶體活性水平呈下降趨勢，均極顯著低于空白對照組(P<0.01)(圖1)。

表1熒光定量PCR引物序列

*P<0.05,**P<0.01

2.2 TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α mRNA水平

與空白對照組相比，HPI+組與HPI-組中TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α 的mRNA水平均高于對照組(圖2)。感染時間4 h～24 h內，HPI+組與HPI-組相比，HPI+組中TLR4 的mRNA水平均高于HPI-組(P<0.01)；4 h時，HPI+組中MyD88 的mRNA水平高于HPI-組(P<0.05)；在感染后12 h時，HPI+組中NF-κB的mRNA水平感染顯著高于HPI-組(P<0.05)，在4 h、6 h、24 h時，HPI+組中NF-κB的mRNA水平高于HPI-組(P<0.01)；4 h～6 h時，HPI+組中IκB-α的mRNA水平均高于HPI-組(P<0.01)。HPI++MG-132組與HPI-+MG-132組中TLR4和MyD88的mRNA水平較對照組較高(P<0.01)，但低于HPI+組和HPI-組，而HPI++MG-132組與HPI-+MG-132組的NF-κB和IκB-α的mRNA水平均低于空白對照組(P<0.01)。

2.3 NF-κB、IκB-α、IL-1、TNF-α蛋白含量

E.coli感染IPEC-J2細胞后，與空白對照組相比，HPI+組與HPI-組中NF-κB、IκB-α、IL-1和TNF-α的蛋白含量略高。感染時間4 h～24 h內，HPI+組的NF-κB和IκB-α的蛋白含量均略高于HPI-組，在6 h和24 h時，NF-κB和IκB-α均表現極顯著(P<0.01)，且NF-κB在12 h時亦表現顯著(P<0.05)；HPI+組與HPI-組中IL-1的蛋白含量除6 h(P<0.05)外無明顯差異；HPI+組和HPI-組中TNF-α的蛋白含量變化始終不明顯。經MG-132處理后的IPEC-J2細胞感染E.coli后，HPI++MG-132組與HPI-+MG-132組中NF-κB、IκB-α、IL-1和TNF-α的蛋白含量低于空白對照組(圖3)。

3 討論

本研究結果顯示，E.coliHPI不僅在一定程度起到了上調IPEC-J2細胞中泛素蛋白酶體活性水平的作用，同時提升了TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA水平，與預期結果一致。E.coliHPI感染IPEC-J2細胞后，IκB-α的mRNA水平及上清中IκB-α的蛋白含量呈升高的趨勢，此結果與文獻報道一致[11]，具體原因仍待研究；E.coliHPI感染正常IPEC-J2細胞后，IL-1和TNF-α的蛋白含量略高于空白對照組。MG-132是一種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，通過阻止26S蛋白酶體對泛素化靶蛋白的降解、抑制20S泛素蛋白酶體的活性，阻斷泛素蛋白酶體途徑[11]。本研究中，當E.coliHPI感染經MG-132處理后的IPEC-J2細胞后，TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA水平降低，IL-1和TNF-α的蛋白含量均低于空白對照組，故以上結果表明，E.coliHPI能夠通過減緩MG-132對IPEC-J2細胞中泛素蛋白酶體活性水平的抑制作用，降低TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA水平，從而減少NF-κB和IκB-α及炎性因子IL-1和TNF-α的蛋白含量。

*P<0.05,**P<0.01

*P<0.05 ；** P<0.01

撒壩豬源E.coliHPI感染IPEC-J2細胞后，可通過激活TLR4/NF-κB信號通路中泛素蛋白酶體的活性，促使其通路中上游關鍵信號分子TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α的mRNA水平升高，誘導相關炎性因子IL-1和TNF-α的表達，從而誘發(fā)IPEC-J2細胞發(fā)生炎癥反應。通過泛素蛋白酶體所介導的TLR4/NF-κB信號通路是否可以作為含有HPI的病原菌的治療靶點還有待進一步深入研究。