王卓怡，蔡建紅，張?jiān)聥?，支遙

(張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇 張家港 215600)

糖尿病是危害人類健康最常見、最主要的慢性代謝病之一。以往研究顯示，全球糖尿病在成人中的發(fā)病率為8.8%，患者人數(shù)達(dá)4.15億[1]。其中，中國(guó)糖尿病的患病人數(shù)為1.1億，居全球首位[1]。第六次全國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)成人糖尿病患病率高達(dá)11.6%[1]。

二甲雙胍(metformin，MET)是一種經(jīng)典的降糖藥物。研究證實(shí)，MET可以減少糖尿病誘發(fā)的多種心血管疾病[2-4]。但是MET對(duì)糖尿病血管損傷的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。自噬是一把“雙刃劍”，在生物體的生理和病理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[5]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1被認(rèn)為是自噬的標(biāo)志物[6]。既往研究證實(shí)，高糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞48 h可以上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，下調(diào)p62，進(jìn)而導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[7]。另外，在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，激活自噬能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，表明自噬和凋亡可能存在某種相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。細(xì)胞凋亡在糖尿病血管損傷中起重要作用，參與糖尿病血管內(nèi)皮損傷的病理過程。研究顯示，高糖可以上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮損傷[8]。但目前細(xì)胞自噬與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不完全明確。本研究通過構(gòu)建糖尿病大鼠模型，旨在探討MET對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷的影響及其分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，體重180～220 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2019-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2019-015，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 Bax抗體(批號(hào)：14796)、Bcl-2抗體(批號(hào)：15071)、LC3抗體(批號(hào)：19848)、p62抗體(批號(hào)：7814)、Beclin-1抗體(批號(hào)：54101)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司(批號(hào)：3697)；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔二抗(批號(hào)：A0277)、辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠二抗(批號(hào)：A0286)、一抗稀釋液(批號(hào)：P0256)、二抗稀釋液(批號(hào)：P0258)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基和耗材購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器和設(shè)備 組織勻漿儀(武漢維塞爾生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：ZW800G)；-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán)生產(chǎn)，型號(hào)：YY-JJ2)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：ULT-25NE)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：Allegra X-15R)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，型號(hào)：TC-XDS-500C)；電鏡(北京京科瑞達(dá)科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：NE910)；免疫印跡檢測(cè)裝置(美國(guó)Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)，型號(hào)：DYCZ-40D)；高純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)，型號(hào)：HAD-Green-30T)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糖尿病大鼠分組與動(dòng)物模型構(gòu)建 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字法分成正常對(duì)照組、糖尿病組、MET藥物處理組，每組15只。糖尿病組和MET藥物處理組大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)，對(duì)照組大鼠注射等量的0.9% NaCl注射液。鏈脲佐菌素注射完成后采用血糖儀檢測(cè)大鼠血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L可視為造模成功。造模成功后，MET藥物處理組大鼠給予40 mg/kg的MET，每日1次；糖尿病組大鼠灌服等劑量的0.9% NaCl注射液，兩組大鼠均持續(xù)灌胃8周，對(duì)照組大鼠持續(xù)喂養(yǎng)8周。檢測(cè)三組大鼠禁食12 h后的體重、血糖和胰島素水平。待給藥時(shí)間到達(dá)進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈血管組織取材，備用。

1.2.2蘇木精-伊紅染色 ①固定：將取得的大鼠主動(dòng)脈血管組織標(biāo)本放置于4%的多聚甲醛內(nèi)進(jìn)行固定，時(shí)長(zhǎng)約30 min；②脫水：將血管組織分別放置于70%、80%、90%、95%、100%不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度脫水；③透明：采用二甲苯將血管組織標(biāo)本透明2次；④浸蠟：將透明標(biāo)本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65 ℃下保溫2 h；⑤包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中后進(jìn)行包埋，待其冷卻凝固為蠟塊；⑥切片：標(biāo)本組織蠟塊用切片機(jī)在其中部自動(dòng)橫行切取3張4 μm厚的薄片；⑦在脫蠟和水洗后，采用蘇木精進(jìn)行染色，保持3 min，繼續(xù)水洗之后藍(lán)化，保持10 min，使用1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min；⑧封片：使用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇依次進(jìn)行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進(jìn)行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。觀察三組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)變化。

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡 ①取出大鼠的主動(dòng)脈血管，剪碎后放置于1.5 mL的組織研磨管內(nèi)，并按照1∶2比例加入組織裂解液放置在已經(jīng)預(yù)冷后的組織勻漿儀中進(jìn)行研磨；②高速離心機(jī)4 ℃ 12 000×g離心15 min，收集血管組織上清液，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行血管組織凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)和自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62)濃度定量測(cè)定；③按照每孔上樣量為40 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜操作，并采用封閉液封閉1～2 h，孵育對(duì)應(yīng)一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于搖床搖晃洗膜，吐溫-20磷酸鹽緩沖溶液洗膜2～3次，每次5 min，滴加顯影液顯影并拍照。

1.2.4自噬小體檢測(cè) 血管組織包埋、切片，厚度5 μL，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬鉛染色，透射電子顯微鏡觀察血管形態(tài)以及自噬小體并對(duì)其拍照。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠體重、血糖、胰島素水平比較 三組大鼠的體重、血糖、胰島素水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，糖尿病組、MET藥物處理組大鼠的體重、胰島素水平均降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)；血糖升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.01)，見表1。蘇木精-伊紅染色顯示，糖尿病組大鼠的血管內(nèi)膜排列紊亂、內(nèi)皮粗糙、中膜增厚；MET藥物處理組大鼠血管內(nèi)皮光滑且排列整體，見圖1。

表1 三組大鼠體重、血糖、胰島素水平比較

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈血管形態(tài)變化(蘇木精-伊紅染色，×400)

2.2三組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較 三組大鼠的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，糖尿病組、MET藥物處理組大鼠的Bax蛋白表達(dá)水平均升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)。見圖2、表2。

2a：Bax蛋白表達(dá)變化；2b：Bcl-2蛋白表達(dá)變化

2.3MET對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮自噬小體的影響 與對(duì)照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組血管內(nèi)皮自噬小體數(shù)量均明顯減少，但MET藥物處理組多于糖尿病組。見圖3。

圖3 各組大鼠電鏡檢測(cè)血管內(nèi)皮自噬小體數(shù)量(×10 000)

2.4三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達(dá)的比較 三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表達(dá)比較

表2 三組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的比較

差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)；p62蛋白表達(dá)水平升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.05)。見表3、圖4。

LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；MET：二甲雙胍4a：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)變化；4b：p62蛋白表達(dá)變化

表3 三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

糖尿病血管病變包括大血管和微血管病變，是誘發(fā)糖尿病患者致死、致殘的主要原因[9]。血管內(nèi)皮功能異常是導(dǎo)致糖尿病血管病變的重要因素[10]。近年來隨著糖尿病患者數(shù)量急劇增加，糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病率亦快速上升。因此，深入研究糖尿病血管內(nèi)皮損傷的分子機(jī)制、尋求有效的靶向藥物防治策略已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

MET是一種經(jīng)典的口服降糖藥物，具有減少糖尿病誘發(fā)心血管疾病發(fā)生、保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。既往研究證實(shí)，MET具有抗炎、降低血壓、降血脂、改善胰島素抵抗、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用[11-12]。但目前有關(guān)MET對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的具體分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的程序性細(xì)胞死亡方式，是糖尿病血管內(nèi)皮損傷的重要原因。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠的血糖升高、體重和血漿胰島素水平顯著降低，表明糖尿病大鼠造模成功；而MET藥物處理組大鼠的體重、胰島素水平高于糖尿病組，血糖低于糖尿病組，表明MET對(duì)糖尿病具有一定的治療效果。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是內(nèi)皮損傷的重要因素，其中Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵性蛋白。本研究中，與對(duì)照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的Bax蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，但MET藥物處理組的Bax蛋白表達(dá)水平低于糖尿病組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于糖尿病組，表明MET能夠抑制高血糖誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，改善血管內(nèi)皮功能。提示MET可通過調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮凋亡，改善糖尿病血管內(nèi)皮損傷。以往研究證實(shí)，MET能夠通過下調(diào)胱天蛋白酶3、Bax，上調(diào)Bcl-2而抑制糖尿病心肌病和糖尿病腎病大鼠心肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡[13-14]。但是有關(guān)MET對(duì)糖尿尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。

細(xì)胞自噬是一種新的調(diào)控細(xì)胞死亡的方式，按照分子機(jī)制可分為巨自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。研究表明，自噬與糖尿病心血管病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5，15]。但是不同的誘因和刺激強(qiáng)度會(huì)激活不同類型細(xì)胞自噬性的保護(hù)或損傷作用。高糖(25 mmol/L)處理心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制細(xì)胞自噬水平，誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[16]。在高糖(33 mmol/L)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24、48 h后，免疫印跡檢測(cè)顯示內(nèi)皮細(xì)胞的Bax表達(dá)增加，自噬水平降低；而通過誘導(dǎo)自噬可以降低Bax表達(dá)，緩解高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]。相反，在高糖處理的心肌細(xì)胞H9c2中培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，細(xì)胞自噬水平升高，凋亡增加，而通過抑制自噬可減少H9c2細(xì)胞的凋亡[13]。上述研究提示，自噬不僅可維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，還可參與血管內(nèi)各種細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的調(diào)控。因此，深入探討自噬對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型中，MET預(yù)處理能夠促進(jìn)自噬形成，改善神經(jīng)損傷[18]；在2型糖尿病腎病大鼠模型中，MET通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，改善糖尿病大鼠腎臟損傷[19-20]。這表明，MET可通過促進(jìn)自噬發(fā)揮多種誘因?qū)е碌男哪X血管損傷[21]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組；p62蛋白表達(dá)水平升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組，表明MET可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，改善血管內(nèi)皮損傷。李冰玉等[22]研究表明，MET能夠調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，從而發(fā)揮血管保護(hù)作用。另外，MET也可以通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)垂體泌乳素瘤細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，MET可降低糖尿病血管內(nèi)皮損傷，其機(jī)制可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果初步揭示了MET對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為MET用于治療糖尿病血管病變提供了新的可能。