李芝豐 ，孫 偉, ，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

發(fā)情周期和產(chǎn)羔數(shù)是影響綿羊產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益關(guān)鍵因素。研究影響產(chǎn)羔數(shù)和發(fā)情周期關(guān)鍵基因可節(jié)約育種成本，縮短世代間隔。TGF-β信號通路廣泛參與、調(diào)控機(jī)體各類生物過程，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長和分化因子、激活素和抑制素等。SMAD4（SMAD family member 4）是TGF-β/SMAD信號通路中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在哺乳動物卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢中特異性敲除SMAD4 基因?qū)е滦∈舐雅葸^早衰竭、顆粒細(xì)胞過早黃體化和產(chǎn)仔數(shù)下降[1]。此外，敲除SMAD4后，小鼠在胚胎期死亡[2]，miRNA也可通過靶向調(diào)控SMAD4影響顆粒細(xì)胞和卵巢功能[3]。

TGFBR2負(fù)責(zé)編碼一種跨膜糖蛋白受體，可與TGF-β配體結(jié)合，與TGFBR1 共同傳遞信號。Ahn等研究表明，敲除TGFBR2會使TGF-β信號通路傳導(dǎo)失效[4]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)TGFBR2一處同義突變（g.5058476C＞T）與湖羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)[5]，且二花臉豬卵巢中該基因表達(dá)量顯著高于商品豬，可能是影響其高繁殖力的候選基因[6]。

BMPs（Bone morphogenetic protein）家 族 屬于TGF-β超家族，在骨成形、胚胎發(fā)育以及生殖過程中均發(fā)揮重要作用。BMPs 通過BMPⅡ型受體磷酸化BMPⅠ型受體，參與BMP/SMAD 信號通路，進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。BMP6最初提取于小鼠胚胎，與BMP 家族同源性較高，命名為BMP6。BMP6 對于調(diào)控哺乳動物卵泡發(fā)育具有重要作用。此外，BMP6遺傳缺失小鼠排卵率下降，卵母細(xì)胞質(zhì)量低，產(chǎn)仔數(shù)也變少[7]。

抑制素（Inhibin，INH）是由一個共同α亞基和兩個不同但同源β鏈（βA 或βB）之一組成的異構(gòu)體，有抑制素A和抑制素B兩種，隸屬于TGF-β超家族。抑制素B（Inhibin subunit beta B，INHBB）基因負(fù)責(zé)編碼由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的INHBB 蛋白，其對哺乳動物卵泡發(fā)育和繁殖具有重要作用。卵泡發(fā)育包括顆粒細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和分化。卵泡早期FSH（促卵泡激素）增加促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌INHBB，進(jìn)入血液循環(huán)后，抑制垂體分泌FSH[8]。此外，INHBB在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡中發(fā)揮重要作用[9]。

S 期激酶相關(guān)蛋白1（S-phase kinase association protein 1，SKP1）是泛素連接酶復(fù)合物SCF 蛋白中核心蛋白，最早在酵母中分離得到，編碼絲粒蛋白，可調(diào)控細(xì)胞周期，泛素化降解[10]。研究表明，敲除SKP1 小鼠二月齡時卵巢僅有少量卵母細(xì)胞，四月齡時消失[11]。過表達(dá)SKP1 蛋白小鼠胚胎發(fā)育受影響，阻斷SKP1 則促進(jìn)胚胎發(fā)育[12]。該基因也是TGF-β/Smads 通路下游調(diào)控因子，在哺乳動物卵泡發(fā)育以及排卵中發(fā)揮重要作用，推測可能影響綿羊繁殖力。

成纖維細(xì)胞生長因子18（Fibroblast growth fac?tor 18，F(xiàn)GF18）是一種分泌性信號分子，以內(nèi)分泌或旁分泌方式在胚胎發(fā)育尤其是骨骼、軟骨發(fā)育過程中具有重要意義[13]。此外，體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞中添加高劑量FGF18 抑制編碼類固醇基因表達(dá)及雌二醇和孕酮合成[14]。FGF18在閉鎖卵泡中表達(dá)顯著高于健康卵泡，體內(nèi)注射FGF18 導(dǎo)致優(yōu)勢卵泡凋亡，體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞可提高caspase-3 水平，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。表明FGF18可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞影響綿羊繁殖過程。

FecB是在BMPRIB基因中發(fā)現(xiàn)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)突變（A746G），小尾寒羊中也檢測到該突變。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB突變具有累加效應(yīng)，每增加一個拷貝可提高1.5 個排卵數(shù)、1～1.5 個產(chǎn)羔數(shù)。本研究選取無FecB突變FecB++型小尾寒羊卵泡期和黃體期生殖軸相關(guān)組織，探究候選基因INH?BB、SMAD4 和FGF18 對發(fā)情性狀的影響；選取FecB++和FecBBB型小尾寒羊卵泡期相關(guān)組織，探究候選基因BMP6、TGFBR2和SKP1對排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的影響，在小尾寒羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織中建立組織表達(dá)譜，以期闡述其在綿羊繁殖中作用，為影響綿羊繁殖力候選基因篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物選擇

本試驗(yàn)選擇體重和體型一致小尾寒羊，均為3產(chǎn)母羊。飼養(yǎng)于山東鄆城種羊場，定時投喂，自由飲水。

根據(jù)前期試驗(yàn)分型結(jié)果[16]，選擇20只FecB++型和FecBBB型母羊。

1.2 發(fā)情處理和樣品采集

利用CIDR陰道栓（澳大利亞Zoetis公司，含有300 mg孕酮）作母羊同期發(fā)情處理。此外，除肌注5 mL VAD，無任何外源激素影響。所有母羊撤栓后45～48 h，選擇FecB++型和FecBBB型母羊各3只屠宰并采集其下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織，此時為卵泡期；撤栓7 d 后屠宰3 只FecB++型母羊并取其下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織，此為黃體期。所有采集組織保存于液氮備用。

選擇可能和發(fā)情性狀相關(guān)候選基因INHBB、SMAD4 和FGF18，將FecB++卵泡期和FecB++黃體期作比較；選擇和產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)候選基因BMP6、TGF?BR2 和SKP1，將FecB++卵泡期和FecBBB卵泡期作比較。

1.3 RNA提取和cDNA合成

將所采集性腺軸相關(guān)組織加液氮研磨后，采用Trizol 法（Invitrogen，美國）提取總RNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 分析儀（Agi?lent Technologies，美國）檢測RNA質(zhì)量和濃度。

使用PrimeScriptTMRT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Bio Inc.，大連）合成第一鏈cDNA。反應(yīng)體系（20 μL）如下：PrimeScript RT 酶1.0 μL、Random 6 mers 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL、總RNA 1.0 μL 和ddH2O 13 μL。于37 ℃15 min、85 ℃5 s條件下反轉(zhuǎn)錄。

1.4 引物設(shè)計和熒光定量

使用Primer-BLAST 在線引物設(shè)計工具，根據(jù)INHBB、SMAD4、FGF18、BMP6、TGFBR2和SKP1 在GenBank 中序列，設(shè)計6 個引物（見表1）。此外，選擇β-actin為內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)化。由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司（北京，中國）合成。

熒光定量反應(yīng)體系如下：SYBR Premix EXTaqII（TaKaRa Bio Inc, Dalian, China）10 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL 和cDNA 2 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃變性5 min、40個循環(huán)95 ℃10 s和60 ℃30 s，分析溶解曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量[17]，使用SPSS 22.0（IBM,Armonk,NY,USA）處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）基因表達(dá)水平顯著性，采用Fisher's least significant difference test 作多重比較檢驗(yàn)衡量比較組間差異，以P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，所有數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量鑒定

使用1.5%瓊脂糖電泳檢測提取RNA 完整性和濃度。28S 和18S 條帶清晰，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)試驗(yàn)（見圖1）。

圖1 RNA電泳檢測Fig.1 Electrophoresis of RNA

2.2 INHBB組織表達(dá)分析

如圖2 所示，INHBB在小尾寒羊5個組織中均表達(dá)，垂體和卵巢中表達(dá)量最高。其中，卵泡期卵巢中INHBB表達(dá)量極顯著高于黃體期卵巢（P＜0.01），卵泡期子宮中表達(dá)量極顯著高于黃體期子宮（P＜0.01），黃體期輸卵管中表達(dá)量極顯著高于卵泡期輸卵管（P＜0.01），下丘腦和黃體期子宮中表達(dá)量較少。

2.3 SMAD4組織表達(dá)分析

如圖3所示，SMAD4在小尾寒羊5個組織兩個時期均表達(dá)，垂體中表達(dá)量最高。其中，黃體期子宮中SMAD4 表達(dá)量極顯著高于卵泡期子宮（P＜0.01）。

圖2 INHBB在小尾寒羊不同發(fā)情時期各組織表達(dá)Fig.2 Expression of INHBB in tissues of different estrus cycle of STH

2.4 FGF18組織表達(dá)分析

如圖4 所示，在小尾寒羊5 個組織中，F(xiàn)GF18在輸卵管中表達(dá)量最高，垂體中表達(dá)量較低，卵泡期輸卵管中該基因表達(dá)量極顯著高于黃體期（P＜0.01）。

2.5 BMP6組織表達(dá)分析

如圖5 所示，BMP6 在小尾寒羊5 個組織中均表達(dá)，在垂體中該基因表達(dá)量最高，F(xiàn)ecBBB型下丘腦中BMP6表達(dá)量極顯著高于FecB++（P＜0.01）。

圖3 SMAD4在小尾寒羊不同發(fā)情時期各組織表達(dá)Fig.3 Expression of SMAD4 in tissues of different estrus cycle of STH

圖4 FGF18在小尾寒羊不同發(fā)情時期各組織表達(dá)Fig.4 Expression of FGF18 in tissues of different estrus cycle of STH

圖5 BMP6在不同基因型小尾寒羊各組織表達(dá)Fig.5 Expression of BMP6 in tissues of different genotypes of STH

2.6 TGFBR2組織表達(dá)分析

如圖6 所示，TGFBR2 在小尾寒羊5 個組織中均表達(dá)，卵巢中該基因表達(dá)量最高，F(xiàn)ecB++型子宮中TGFBR2表達(dá)量極顯著高于FecBBB型（P＜0.01）。

2.7 SKP1組織表達(dá)分析

如圖7 所示，SKP1在小尾寒羊5個組織中均表達(dá)，下丘腦和垂體中該基因表達(dá)量最高，F(xiàn)ecBBB型垂體中SKP1表達(dá)量極顯著高于FecB++型（P＜0.01）。

圖6 TGFBR2在不同基因型小尾寒羊各組織表達(dá)Fig.6 Expression of TGFBR2 in tissues of different genotypes of STH

圖7 SKP1在不同基因型小尾寒羊各組織表達(dá)Fig.7 Expression of SKP1 in tissues of different genotypes of STH

3 討 論

3.1 INHBB、SMAD4和FGF18對發(fā)情周期的影響

研究表明，INHBB在綿羊下丘腦和垂體中表達(dá)。在卵泡期早期，隨FSH 和E2 活躍，刺激卵巢顆粒細(xì)胞開始分泌INHBB，隨卵泡募集，表達(dá)量明顯增加[8]，并在卵泡中期達(dá)到最高，與卵泡生長趨勢一致[18]。本試驗(yàn)中，該基因在小尾寒羊下丘腦和垂體中均表達(dá)，且在卵泡期卵巢中表達(dá)極顯著高于黃體期，與上述研究結(jié)果一致。此外，黃體形成后INHBB 分泌抑制垂體FSH 合成，這是INH?BB負(fù)反饋?zhàn)饔茫赡軐?dǎo)致垂體中抑制素表達(dá)量升高。敲除INHBB導(dǎo)致小鼠顆粒細(xì)胞停滯在G1 期，其細(xì)胞凋亡率上升[19]，暗示抑制素B在卵泡發(fā)育中調(diào)控作用可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，推測可能在綿羊發(fā)情周期中有一定影響。

SMAD4 在牦牛下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管中均表達(dá)[20]，大鼠不同發(fā)情階段中子宮內(nèi)膜和卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)量無顯著差異[21]。蓋玉強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)卵巢中SMAD4 mRNA 在發(fā)情間期最低，發(fā)情期最高，且顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中也有蛋白表達(dá)[22]。本試驗(yàn)中SMAD4 在綿羊5 個組織中均表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，但黃體期子宮中SMAD4表達(dá)量極顯著高于卵泡期子宮，與大鼠子宮中表達(dá)規(guī)律不一致，可能因物種不同有關(guān)。此外，SMAD4為介導(dǎo)TGF-β信號通路唯一Co-SMAD[2]。SMAD4 可能通過調(diào)控卵泡和顆粒細(xì)胞發(fā)育影響綿羊發(fā)情過程。

研究發(fā)現(xiàn)子宮中FGF18 表達(dá)量在妊娠期最高，其次是黃體期和卵泡期，而在輸卵管中表達(dá)量在卵泡期最高，其次是黃體期和妊娠期[23]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)GF18在輸卵管中表達(dá)量最高，且卵泡期輸卵管中該基因表達(dá)量極顯著高于黃體期，與上述研究結(jié)果一致。這可能與FGF18 抑制雌激素分泌與誘導(dǎo)卵泡凋亡有關(guān)[14]，卵巢中該基因低表達(dá)有利于卵泡發(fā)育，而輸卵管中高表達(dá)則可能與FGF18維持胚胎發(fā)育有關(guān)[13]。

3.2 BMP6、TGFBR2和SKP1對繁殖力的影響

研究發(fā)現(xiàn)BMP6 僅在發(fā)情湖羊卵巢、輸卵管、腎臟和肌肉中表達(dá)[24]，單多羔綿羊卵巢中表達(dá)量無顯著差異。本試驗(yàn)中，BMP6在下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管中均表達(dá)，卵巢中表達(dá)量最高，不同基因型卵巢中表達(dá)量無顯著差異。BMP6可刺激LβT2 細(xì)胞增加FSH 分泌，抗體中和BMP6后分泌大幅下降，可能影響FSH合成和分泌[25]。在體外培養(yǎng)豬卵巢膜細(xì)胞中，BMP6也可抑制孕酮和cAMP產(chǎn)生，但不影響其增殖和存活[26]，說明BMP6可能是黃體化抑制因子，推測BMP6在卵巢中高表達(dá)可抑制黃體化合成相關(guān)物質(zhì)。此外，BMPR1B點(diǎn)突變（Q249R，F(xiàn)ecB）導(dǎo)致其與BMP6 結(jié)合力下降，使BMP6 對cAMP 抑制能力降低，由此增強(qiáng)對FSH敏感性，導(dǎo)致繁殖力提高。

TGFBR2在哺乳動物各組織中廣泛表達(dá)，但在卵巢、子宮和輸卵管等生殖器官中具有高表達(dá)特征[27]。本試驗(yàn)中卵巢、子宮和輸卵管表達(dá)量最高，表達(dá)特征一致。研究發(fā)現(xiàn)，高繁殖力湖羊卵巢中TGFBR2表達(dá)量顯著高于低繁殖力湖羊，且表達(dá)量與排卵率呈正相關(guān)[24]。miR-1306 可靶向TGFBR2，使TGF-β/SMAD 通路失活，調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡[28]。在二花臉豬和湖羊中試驗(yàn)表明TGFBR2可能是影響繁殖力關(guān)鍵基因[5-6]。因此，TGFBR2可能對小尾寒羊繁殖力有一定影響。

SKP1 介導(dǎo)不同細(xì)胞周期蛋白泛素化降解，調(diào)控細(xì)胞周期。SKP1 蛋白過表達(dá)使小鼠胚胎發(fā)育受阻，死亡率提高[12]。SKP1 在卵母細(xì)胞中表達(dá)，胚胎中主要位于囊胚細(xì)胞核內(nèi)，提示可能在卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用[29]。本試驗(yàn)中，SKP1 在小尾寒羊5 個組織中均表達(dá)，下丘腦和垂體中該基因表達(dá)量最高。徐夢思等發(fā)現(xiàn)SKP1 在梅山豬輸卵管和子宮中表達(dá)量最高[30]，與本研究結(jié)果不一致，可能與物種不同有關(guān)。此外，豬不同卵泡差異表達(dá)序列標(biāo)簽中，TGF-β通路富集程度最高[31]，推測SKP1 基因也與綿羊卵泡發(fā)育有關(guān)，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用熒光定量PCR 檢測小尾寒羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮中INHBB、SMAD4和FGF18（卵泡期和黃體期），以及BMP6、TGF?BR2和SKP1（FecB++和FecBBB）表達(dá)特征存在差異，6個基因?qū)d羊繁殖力有一定影響，為綿羊繁殖力相關(guān)候選基因研究提供參考。