鮑彤彤 ，郜陸敏 ，張玉梅，吳 信，劉春龍

（1.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

飼養(yǎng)密度是畜禽養(yǎng)殖重要參數(shù)之一，影響豬群健康和福利水平[1]。研究表明，飼養(yǎng)密度過低導(dǎo)致土地等資源浪費(fèi)，增加豬維持凈能，不利于脂質(zhì)積累；飼養(yǎng)密度過高顯著降低豬群平均日增重，不利于經(jīng)濟(jì)效益[2]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，選擇合適飼養(yǎng)密度對(duì)于平衡經(jīng)濟(jì)效益和豬群健康至關(guān)重要。

動(dòng)物遇到有害刺激時(shí)，可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和行為反應(yīng)規(guī)避應(yīng)激對(duì)機(jī)體影響。飼養(yǎng)密度過高，個(gè)體活動(dòng)空間受限，動(dòng)物無法及時(shí)規(guī)避應(yīng)激源，導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)增加[3]。血液抗氧化指標(biāo)常被認(rèn)為是應(yīng)激標(biāo)志物[4]。研究表明，飼養(yǎng)密度過高破壞動(dòng)物體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體活性氧（ROS）水平升高，造成氧化應(yīng)激，影響各類代謝反應(yīng)[5]。機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)是對(duì)抗ROS的主要防御機(jī)制之一，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等[6]。核苷酸及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是氧化還原反應(yīng)中傳遞電子的輔酶，參與三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等[7]，同時(shí)也是嘧啶核苷酸合成重要物質(zhì)[8-9]。尿苷可與脂肪組織、膽汁酸等共同作用，調(diào)控機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)[10]。飼糧中添加單磷酸尿苷或尿苷類核苷酸可促進(jìn)斷奶仔豬腸道發(fā)育，緩解斷奶應(yīng)激[11]。另外，飼糧中添加外源核苷酸可提高斷奶仔豬免疫功能，提高機(jī)體抗應(yīng)激能力，進(jìn)而提高仔豬生長(zhǎng)性能[12]。目前關(guān)于核苷酸代謝與應(yīng)激研究多集中于添加外源核苷酸可緩解機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)方面，但飼養(yǎng)密度是否影響仔豬核苷酸代謝尚未見報(bào)道。

因此，本研究探討飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬抗氧化能力、嘧啶核苷酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在為生豬養(yǎng)殖業(yè)飼養(yǎng)密度合理選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重相近（10.32±0.07 kg）31 日齡仔豬（長(zhǎng)白×大約克郡）66 頭，隨機(jī)分為3 組，每組6 個(gè)重復(fù)：A 組（低密度組）：2 m2內(nèi)飼養(yǎng)2 頭仔豬；B 組（中密度組）：2 m2內(nèi)飼養(yǎng)3 頭仔豬；C 組（高密度組）：2 m2內(nèi)飼養(yǎng)6頭仔豬。

1.2 飼養(yǎng)管理

仔豬飼糧組成參照NRC（2012），符合該階段仔豬營(yíng)養(yǎng)需求。仔豬自由采食，飲水充足。飼養(yǎng)前對(duì)豬舍全面消毒并保持干燥，圈舍溫度18～26 ℃，舍內(nèi)自然通風(fēng)，試驗(yàn)期30 d?；A(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣本采集

試驗(yàn)30d后，從各組隨機(jī)抽取1頭仔豬，禁食12 h，電擊麻醉（120 V，200 Hz），頸靜脈采血后屠宰取樣。采集空腸和肝臟樣品置于液氮速凍，于-80 ℃保存。血液樣本室溫靜置2 h后，于4 ℃條件下，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，于-80 ℃保存。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Basal diet composition and nutritional level

1.4 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定

抗氧化相關(guān)試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國(guó)，南京）和多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，瑞士）測(cè)定仔豬血清中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）水平，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 肝臟NAD+/NADH測(cè)定

NAD+/NADH 檢測(cè)試劑盒（WST-8 法）測(cè)定肝臟中NAD+與NADH 比值（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，上海）。根據(jù)試劑盒說明書操作后，用多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，瑞士）檢測(cè)吸光值。并根據(jù)以下公式計(jì)算樣品中NAD+含量及NAD+/NADH 比值，NAD+和NADH 總量或各自含量用單位肝臟重量中含量表示。

1.6 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR

取適量仔豬肝臟和空腸組織樣，在液氮中磨成粉狀后加入Trizol（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，上海），提取總RNA?？俁NA濃度采用紫外比色法測(cè)定，RNA 質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，并用DNase 去除DNA。反轉(zhuǎn)錄過程參照試劑盒說明書（TaKaRa 生物科技股份有限公司，中國(guó)，大連），即得到cDNA。

通過GenBank獲取相關(guān)基因序列，Prime 5.0設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)中使用引物序列見表2。參照試劑盒（Takara SYBR II，中國(guó)，大連）說明書，使用羅氏熒光定量PCR 儀（LightCycler 480II，德國(guó)，瑞士）作PCR擴(kuò)增，檢測(cè)β-actin及核苷酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等基因相對(duì)mRNA 表達(dá)水平。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2 qPCR擴(kuò)增反應(yīng)中正向和反向引物序列Table 2 Forward and reverse primer sequences in qPCR amplification reactions

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0 軟件作單因素方差分析（ANO?VA），然后作Duncan 多重比較檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬血清抗氧化能力的影響

飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬抗氧化指標(biāo)影響如表3 所示。與低密度組相比，高飼養(yǎng)密度顯著降低仔豬血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。與中密度組相比，高飼養(yǎng)密度顯著升高仔豬血清中丙二醛（MDA）水平，降低GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。

2.2 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟NAD+/NADH的影響

飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟NAD+/NADH 的影響如圖1所示，與低密度組相比，高飼養(yǎng)密度顯著上調(diào)仔豬肝臟中NAD+/NADH比值（P＜0.05）。

表3 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬血清抗氧化能力的影響Table 3 Effect of stocking density on antioxidant capacity in serum of piglets

圖1 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟NAD+/NADH的影響Fig.1 Effect of stocking density on the ratio of NAD+to NADH in liver of piglets

2.3 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬嘧啶核苷酸代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟嘧啶核苷酸合成相關(guān)基因mRNA 表達(dá)影響如圖2 所示。與低密度組和中密度組相比，高飼養(yǎng)密度極顯著下調(diào)仔豬肝臟中尿苷單磷酸合成酶（UMPs）mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01）。與低密度組相比，高飼養(yǎng)密度組顯著上調(diào)肝臟中核糖核苷酸還原酶M（RRM）mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。

飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬空腸嘧啶核苷酸合成相關(guān)基因mRNA 表達(dá)影響見圖3。與低密度組和中密度組相比，高飼養(yǎng)密度顯著上調(diào)仔豬腸道中氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶和二氫羥色胺酶尿苷單磷酸合成酶（CAD）mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05）。與低密度組相比，高飼養(yǎng)密度極顯著上調(diào)腸道中UMPs的mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。

飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬空腸嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA 表達(dá)影響如圖4 所示。與低密度組相比，高飼養(yǎng)密度顯著上調(diào)仔豬腸道中嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因SLC28A1、SLC28A2和SLC28A3的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。與低密度組相比，中密度組SLC28A3的mRNA表達(dá)水平也顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖2 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟核苷酸合成相關(guān)酶mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in liver of piglets

圖3 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬空腸核苷酸合成相關(guān)酶mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in jejunum of piglets

圖4 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬空腸核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide transport-related genes in the jejunum of piglets

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬血清抗氧化能力的影響

氧化應(yīng)激是指動(dòng)物體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，產(chǎn)生大量自由基，引起機(jī)體氧化損傷[13]。在集約化養(yǎng)殖過程中，應(yīng)激源無處不在，對(duì)機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響[14]。研究表明，高飼養(yǎng)密度增加機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生，破壞機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)[15]。本研究中，高飼養(yǎng)密度顯著降低仔豬血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平，與高飼養(yǎng)密度顯著降低大菱鲆血清中SOD、GSH-PX、CAT 等抗氧酶指標(biāo)結(jié)果一致[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，高飼養(yǎng)密度可能破壞仔豬氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體易受自由基攻擊，產(chǎn)生氧化損傷。

MDA 是反映氧化應(yīng)激中脂質(zhì)過氧化水平重要參數(shù)[17]。研究表明，高飼養(yǎng)密度引起肉雞氧化應(yīng)激，血清中MDA 水平顯著升高[18]。氧化應(yīng)激破壞ROS 產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)之間平衡，刺激ROS 形成，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加[19]。本研究中，與中密度組相比，高飼養(yǎng)密度組仔豬血清中MDA 水平顯著升高，與高飼養(yǎng)密度顯著增加肉雞血清中MAD 結(jié)果一致，表明高飼養(yǎng)密度引起仔豬氧化應(yīng)激。

3.2 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬肝臟NAD+/NADH的影響

肝臟是哺乳動(dòng)物最重要代謝器官，參與糖、脂、蛋白、核苷酸等多種代謝反應(yīng)。NAD+作為一種傳遞電子輔酶，幾乎參與肝臟中各類代謝反應(yīng)，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)等能量代謝中發(fā)揮不可替代作用[20]。研究表明，降低NAD+/NADH 比值可通過催化α-酮戊二酸脫氫酶（A-KG?DH）活性促進(jìn)ROS 產(chǎn)生[21]。NAD+也是蛋白質(zhì)相互作用和DNA 修復(fù)的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，NAD+可通過提高PPAR活性，提高細(xì)胞氧化損傷DNA修復(fù)能力[22]。另外，NAD+通過激活SIRT1，修復(fù)氧化損傷的血管[23]。本研究中高密度組肝臟NAD+/NADH 比值顯著高于低密度組，可能是高飼養(yǎng)密度條件下肝細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，機(jī)體通過上調(diào)NAD+/NADH比值抑制ROS產(chǎn)生，減輕肝臟細(xì)胞氧化損傷。

3.3 飼養(yǎng)密度對(duì)仔豬嘧啶核苷酸代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

仔豬合成嘧啶核苷酸主要包括從頭合成和補(bǔ)救合成兩種途徑。從頭合成主要發(fā)生于肝臟，需消耗大量能量。補(bǔ)救合成則可利用體內(nèi)游離的核苷和堿基，經(jīng)簡(jiǎn)單反應(yīng)生成嘌呤核苷酸，該過程耗能較少。本試驗(yàn)中，高密度組仔豬肝臟中嘧啶核苷代謝從頭合成關(guān)鍵酶UMPs 的mRNA 表達(dá)量顯著降低，而補(bǔ)救合成關(guān)鍵酶RRM 的mRNA 表達(dá)量較低密度組顯著升高。Ghoshal 等比較分析肝臟代謝組學(xué)，發(fā)現(xiàn)肝臟受到損傷時(shí)，核苷酸及其代謝產(chǎn)物均受影響[24]。因此推測(cè)，本試驗(yàn)中從嘧啶核苷酸頭合成相關(guān)基因表達(dá)受抑制可能與高飼養(yǎng)密度引起仔豬肝臟氧化損傷有關(guān)。此外，動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，需更多能量應(yīng)對(duì)機(jī)體應(yīng)激綜合反應(yīng)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[25]。研究表明，補(bǔ)充外源核苷酸可調(diào)控能量代謝，結(jié)合上述肝臟NAD+/NADH 結(jié)果，提示高飼養(yǎng)密度可能通過影響仔豬核苷酸代謝調(diào)控機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下能量代謝[26-27]。由于補(bǔ)救合成節(jié)省能量和氨基酸消耗，因此推測(cè)高飼養(yǎng)密度對(duì)肝臟嘧啶核苷酸合成的影響也可能是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下自我調(diào)節(jié)，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步探究。

機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)對(duì)核苷酸需求量迅速增加，核苷酸促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖和組織修復(fù)，研究表明，添加外源核苷酸有效增加斷奶仔豬腸道絨毛高度和隱窩深度、促進(jìn)細(xì)胞增殖，緩解斷奶應(yīng)激[28]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在未出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)仔豬日糧中添加外源核苷時(shí)，仔豬腸道結(jié)構(gòu)未有明顯改變[29]，說明腸道對(duì)核苷酸需求可能與機(jī)體健康相關(guān)。本試驗(yàn)中，高飼養(yǎng)密度組仔豬腸道中嘧啶核苷酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵酶CAD、UMPs、SLC28A1、SLC28A2 和SLC28A3 的mRNA 表達(dá)量均顯著上調(diào)，可能與應(yīng)激狀態(tài)時(shí)小腸對(duì)核苷酸需求量增加有關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，高飼養(yǎng)密度降低仔豬抗氧化能力，影響嘧啶核苷酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與高飼養(yǎng)密度引起仔豬應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。因此，集約化養(yǎng)殖模式下，應(yīng)注意飼養(yǎng)密度過高帶來的不利影響，合理選擇飼養(yǎng)密度。