謝夢瀟 王 欣

首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院(100026)

人類Rh血型系統(tǒng)是臨床最重要的血型系統(tǒng)之一，由C、c、D、E、e抗原組成，由位于1號染色體短臂1P34.3-1P36.1上2個緊密連鎖高度同源的RHD和RHCE基因編碼。其抗原強弱依次為D>E>C>c>e，由于D抗原性最強，因此根據(jù)紅細胞上D抗原的有無可分為RhD陽性和RhD陰性。RhD陰性女性接觸RhD陽性紅細胞而致敏[1]，當D抗原再次進入已致敏的母體循環(huán)后，記憶B淋巴細胞在短時間內產生大量可通過胎盤的lgG抗體。這些抗體進入胎兒循環(huán)，識別胎兒紅細胞表面抗原并與之結合，引發(fā)胎兒體內免疫反應，即發(fā)生溶血，導致胎兒貧血或新生兒溶血病，造成新生兒不同程度溶血、水腫、黃疸、肝脾腫大等臨床癥狀，嚴重可造成新生兒死亡[2]。胎兒和新生兒溶血性疾病的治療取決于胎兒貧血的嚴重程度。若病情較輕，胎兒可通過增加紅細胞生成代償紅細胞的破壞。若病情進一步加重則需要進行宮內輸血治療或剖宮產終止妊娠，胎兒出生后仍需要進行血液交換或完全性的輸血治療。因此，Rh陰性孕婦的孕期監(jiān)測及新生兒Rh血型的出生前診斷對新生兒溶血病的預防和治療具有重要意義。

1 Rh陰性孕婦的孕期監(jiān)測

妊娠30天，RhD抗原作為紅細胞膜的一部分被表達且僅存在于紅細胞上。母體RhD同種異體免疫發(fā)生的原因是母體免疫系統(tǒng)暴露于RhD陽性紅細胞中，妊娠女性一旦產生抗D IgG抗體，就會穿過胎盤并對胎兒的紅細胞產生調理素作用，胎兒紅細胞會在胎脾中被巨噬細胞吞噬。但母體巨噬細胞吞噬RhD血型不合的胎兒的紅細跑,需經過一段時間才能釋放出足夠的抗原,且初發(fā)免疫反應發(fā)展緩慢,所產生的抗體為不能通過胎盤屏障的IgM,故RhD血型不合溶血病常發(fā)生于再次妊娠,其中胎兒-母體輸血是同種免疫反應的基礎[1]。使用流式細胞儀的研究表明，在幾乎所有的妊娠中均有微量(0.1ml)的胎兒紅細胞進入母體循環(huán)[3]。自發(fā)性胎母輸血的發(fā)生率和出血量隨著孕齡的增加而增加，分娩時最高[4]。母胎輸血也可能由自然流產、妊娠終止、異位妊娠、侵入性宮內操作、死胎、母體腹部創(chuàng)傷、產前母體出血和外部胎頭倒轉術導致。

但也有報道稱在母體沒有明確接觸攜帶D抗原的紅細胞情況下，卻檢測到抗RhD抗原同種抗體[5]。這可能是因為臨床上未識別的早期妊娠丟失(包括雙胎自然減滅)的結果。另外，還有學者提出病因為“外祖母理論”，即宮內致敏所導致。除母體接觸的胎兒血量外，初次免疫應答的發(fā)生與否還取決于其他一些因素。這些因素包括母胎輸血的次數(shù)和母胎是否為ABO血型相容[6]。胎兒紅細胞的免疫原性和母親免疫源應答的能力在發(fā)病機制中均起一定作用。

我國漢族人群Rh陰性的概率為0.28%[7]。Rh血清學陰性者接受Rh陽性血液后發(fā)生同種免疫者占50%～75%，Rh陰性孕婦發(fā)生新生兒溶血癥者占其中的5%～7%[8]，隨著我國全面兩孩政策的實施，Rh陰性婦女面臨著再生育問題，加上我國人工流產婦女數(shù)量較多，很多Rh陰性婦女有著多次妊娠史，使得其再次妊娠面臨很大的風險。

2 母兒Rh血型不合的預防及臨床檢驗

在無免疫預防措施的20世紀50年代，各類型新生兒溶血癥的發(fā)病率高達1/2200。到了20世紀60年代晚期，隨著新生兒預防性注射抗D疫球蛋白的廣泛應用，Rh陰性婦女發(fā)生D抗原反應的頻率從17%降到1%左右[9]。一篇納入33 715例患者的meta分析顯示Rh血型陰性孕婦產前應用D免疫球蛋白可降低致敏率[10]，胎兒出生前進行預防性抗D治療可以將免疫反應降至0.2%[11]。目前抗D免疫球蛋白的作用機制尚未明確，其可能并不是靠清除所有胎兒RhD陽性紅細胞而發(fā)揮作用，還可能具有阻止免疫起始階段的作用。目前國內外采用的標準預防方案是對于所有Rh陰性孕婦，不論胎次及胎兒血型，均推薦在孕28周，分娩后72 h內，以及流產、絨毛取樣、羊膜腔穿刺等胎兒血液暴露事件后常規(guī)注射抗-D免疫球蛋白。該方案大幅降低了胎兒與新生兒Rh相關溶血性疾病的發(fā)生，但也導致38%的孕有Rh陰性胎兒的孕婦接受不必要的抗-D免疫球蛋白注射，以及相關的用藥風險(過敏反應、血液傳播疾病)和治療費用的增加[12]。雖然抗-D抗體是引起絕大數(shù)胎兒與新生兒Rh相關溶血的原因，但Rh抗原-抗體系統(tǒng)中的抗-C、抗-E抗體可導致另一部分Rh溶血，且比例逐漸上升，有研究報道發(fā)生新生兒溶血癥以抗-E抗體居多[13]，而針對上述抗體目前尚無有效的預防方案[12]。

用于母體的抗D免疫球蛋白可通過胎盤進入胎兒體內,這些抗體也有使胎兒發(fā)生溶血的風險。研究發(fā)現(xiàn),在足月RhD陽性新生兒中,有20%直接抗人球蛋白試驗陽性,但是并無發(fā)生溶血的證據(jù)[14]?？紤]到RhD陰性母親在28孕周時常規(guī)使用抗D免疫球蛋白,此時高抗體滴度可能增加28孕周左右出生的早產兒的溶血風險。隨后在早產兒中進行的回顧性研究結果也未見溶血相關表現(xiàn)[15]。

自從認識到母兒Rh血型不合的危害后，產科醫(yī)生高度關注，一直期望發(fā)現(xiàn)早期診斷的方法。目前臨床上常用的診斷方法是超聲監(jiān)測、大腦中動脈血流監(jiān)測、孕期血型抗體監(jiān)測、羊水膽紅素檢查等手段。但對此不能準確做出診斷與評估，只是間接根據(jù)監(jiān)測結果推斷否存在母兒血型不合以及胎兒溶血的程度。

2.1 超聲監(jiān)測

嚴重貧血可以導致胎兒水腫，其發(fā)生機制可能為貧血導致胎兒心臟輸出量增加和髓外紅細胞生成(大部分位于肝臟)。嚴重貧血導致高輸出性心力衰竭和門靜脈系統(tǒng)高壓從而導致胎兒水腫。如果胎兒血紅蛋白缺乏程度為胎齡相應均值以下至少7g/dl(相當于血細胞比容低于約15%或血紅蛋白<5g/dl)，則會發(fā)生積水[16]。胎兒水腫臨床表現(xiàn)出現(xiàn)至少下列兩種情況：皮膚水腫、腹水、心包積液和胸腔積液。一項對156例超聲發(fā)現(xiàn)胎兒水腫病例的回顧性分析顯示，胎兒存活率為17.9%(28/156)，其中3例原因為母兒Rh血型不合引起的水腫，2例死亡，1例失訪[17]。嚴重水腫者圍生兒病死率可高達50%～100%[18]。因此當B超出現(xiàn)胎兒胸水、腹水、心胸比例增大、肝臟腫大、胎兒皮膚水腫、胎盤增大、羊水增多、胎兒畸形等典型的溶血性水腫表現(xiàn)時，胎兒的預后很差[19]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)胎兒大腦中動脈多普勒超聲值異?？梢栽谔核[發(fā)生前識別胎兒貧血。多普勒超聲對胎兒大腦中動脈(MCA)收縮期峰值流速(PSV)的評估是基于胎兒血紅蛋白水平決定MCA血流的原理：隨著胎兒血紅蛋白水平下降，MCA-PSV升高。一項包括9項觀察性研究在內的系統(tǒng)性綜述表明,多普勒超聲檢查MCA-PSV可以作為篩查任何病因導致嚴重胎兒貧血的工具[20]。重度貧血為胎兒血紅蛋白<0.55MoMs，多普勒超聲檢查MCA-PSV評估的敏感性和特異性分別為75.5%和90.8%；對111例因母體紅細胞同種免疫而有貧血風險的胎兒進行聯(lián)合穿刺術和MCA-PSV檢測，并與265例正常胎兒的血紅蛋白水平進行了比較，結果無論有無胎兒水腫，MCA-PSV升高(>1.5MoMs)對預測中度或重度貧血的敏感性為100%(95%CI 86～100)，假陽性率為12%[21-22]。一項前瞻性研究顯示，MCA-PSV為中度到重度貧血(血紅蛋白水平<0.65MoMs)的敏感性為88%，特異性為87%，陽性預測值53%，陰性預測值98%[22]。

MCA-PSV檢查的時間間隔應取決于先前的病史、孕周以及MCA-PSV檢測的MoM值。應持續(xù)監(jiān)測并延長至可進行胎兒血液采樣或宮內輸血的孕周，通常為孕 18～20 周。專家建議根據(jù)臨床經驗和已知的進展情況，每隔1～2周監(jiān)測胎兒貧血的進展，當接近1.5MoMs時，監(jiān)測頻率應增加[21]。MCA-PSV的測量技術很重要，應在胎兒處于安靜的行為狀態(tài)時進行，因為當胎兒處于活動狀態(tài)時，測量結果存在誤差[23-24]。

母胎醫(yī)學協(xié)會和美國婦產科學院指南指出，MCA-PSV≤1.5MoMs無中度至重度貧血。如果維持在這一水平，可在妊娠37+0～38+6周分娩[25]。且從妊娠32周開始應每周進行產前檢查，嚴密監(jiān)測胎兒情況。

2.2 間接抗球蛋白檢測

對于Rh陰性孕婦首次就診時應進行間接抗球蛋白檢測判斷孕婦是否致敏。陽性則為已致敏，陰性為未致敏。根據(jù)既往妊娠史可將孕婦分為首次致敏和再次致敏。對于首次致敏者，若抗體滴度穩(wěn)定，則每月監(jiān)測即可；若滴度升高則應每2周監(jiān)測，直至達到臨界滴度。臨界滴度是指在特定機構背景下與發(fā)生重度貧血和胎兒水腫風險相關的滴度。低于臨界滴度，胎兒有發(fā)展成輕度至中度貧血的危險，但不會很嚴重。目前認為抗D的滴度以16～32為臨界值，歐洲和英國設定臨界值為15U/ml[26]。如果達到或超過臨界滴度，則需要通過測定多普勒MCA-PSV進一步評估胎兒是否貧血。

連續(xù)的滴度測定應由同一實驗室進行，因為實驗室間存在滴度差異。雖然實驗室內滴度差異也可能存在，但在某一特定實驗室重復檢測時，對于真正穩(wěn)定的滴度，其變異性不超過1個稀釋度。即滴定度呈現(xiàn)4倍增加時才很可能代表真實的增加。

間接抗球蛋白檢測僅是對于初次致敏者的篩查手段，而不能診斷胎兒是否發(fā)生溶血及預測溶血是否進展。即使低于臨界滴度，胎兒也有發(fā)生貧血的風險。對于再次致敏者，間接抗球蛋白檢測抗體滴度不足以評估胎兒發(fā)生溶血的風險，因此孕期不建議監(jiān)測抗體滴度[2]。

2.3 羊膜穿刺術測定羊水膽紅素(AFB)水平

羊膜穿刺術測定AFB水平是間接估計胎兒貧血嚴重程度的傳統(tǒng)方法。AFB來源于胎兒肺部和氣管的流出物，與胎兒溶血程度有關[27-28]。高恩鈺等[29]研究表明，新生兒溶血的發(fā)病和嚴重程度與AFB含量密切相關，正常妊娠AFB在20～23孕周出現(xiàn)峰值達4.104umol/L，以后逐漸下降，至30孕周后漸趨于0，基本上與國外報道相符；含量的峰值估計與胎兒紅細胞的生成量和胎肝成熟度有關，34孕周后AFB>17.1umol/L，提示胎兒紅細胞極度破壞，危及胎兒生命，當羊水L/S比值>2.0時，建議臨床應考慮立即終止妊娠；AFB>8.55umol/L而<17.1pmol/L反映胎兒紅細胞破壞嚴重，當羊水羊水卵磷脂/鞘磷脂比值(L/S)>2.5時，臨床可考慮提早終止妊娠；AFB<8.55pmol/L估計胎兒紅細胞可能受累，但破壞不嚴重，臨床可根據(jù)孕婦健康狀況,考慮等待自然分娩。胎兒的血液樣本可以精確地確定胎兒貧血的嚴重程度，但這一過程有1%～2%的胎兒死亡風險，其中胎齡較低和積水胎兒的風險最高。因此AFB水平和連續(xù)的胎兒血液檢測目前很少用于篩查胎兒貧血情況。

2.4 出生前確定胎兒RhD血型

出生前確定胎兒RhD血型即首先明確胎兒是否有風險，再有針對性的個體化進行孕期監(jiān)測管理。RhD陰性胎兒因為不攜帶目標抗原，從而不存在溶血風險。如果胎兒的生父是RhD陰性，則胎兒也必定是RhD陰性。母親的同種異體免疫是由于先前與RhD陽性伴侶懷孕或其他來源的RhD陽性紅細胞(如不相容輸血、共用針頭)所致。RhD陰性胎兒不存在溶血性疾病的風險，沒有必要進行進一步的評估、監(jiān)測和干預，除非發(fā)生了涉及非RhD紅細胞抗體的母體同種免疫[30]。

如果胎兒的生物學父親是RhD陽性，需要確定父親的合子率。所有RhD陽性純合子的后代均為RhD陽性，因此無需對胎兒RhD型進行進一步檢測。雜合子產生RhD陰性后代的幾率為50%，在這種情況下，需要確定胎兒Rh(D)類型。胎兒RhD型別檢測可以通過有創(chuàng)和無創(chuàng)兩種方式。

2.4.1臍血穿刺確定胎兒Rh血型傳統(tǒng)的胎兒產前診斷檢測胎兒Rh血型是通過臍靜脈穿刺，采集臍血進行細胞核型分析獲取胎兒染色體信息，有創(chuàng)檢測的準確率為98%-99%，但伴有0.5%～1.0%的流產風險，同時也會伴有羊水滲漏、宮內感染等風險[19]。且其技術要求高，在臨床上未廣泛應用于胎兒血型檢測。若是Rh陰性孕婦因其他適應證(如診斷為非整倍體)需要行羊膜穿刺術，可以同時確定胎兒RhD基因型別。羊水檢測胎兒RhD陰性時，應通過對母體DNA和羊水源DNA進行單核苷酸多態(tài)性相關檢測，排除因母體細胞污染導致的假陰性結果。應避免經胎盤羊膜穿刺術及絨毛膜絨毛活檢，有引起胎兒流產以及加重的風險。

2.4.2母親外周血高通量測序確定胎兒Rh血型胎盤合體滋養(yǎng)層含有滋養(yǎng)細胞來源的胎兒細胞核，合體滋養(yǎng)層發(fā)生凋亡后可釋放大量的凋亡小泡進入母體外周循環(huán)，小泡中包含的胎兒有核細胞的DNA片段會隨著小泡的溶解、破裂而混入母血中，形成無細胞的胎兒游離DNA(cfDNA)，其攜帶有RH基因位點，為非侵入性產前診斷胎兒RhD血型提供了理論依據(jù)[31]。

目前已推薦進行的檢測有RhD外顯子4、外顯子5和7、外顯子4、5和7，或外顯子4、5、7和10，且檢測時間應為妊娠10周后，因為此時有足夠的胎兒細胞游離DNA(cf DNA)，能夠達到臨床檢測標準[9]。如果在母體血漿中檢測到這些RhD外顯子，表明存在胎兒cfDNA，胎兒為RhD陽性。如果不存在RhD外顯子，且可證明所檢測到的是胎兒cfDNA而非母體cfDNA，則胎兒為RhD陰性。血漿樣本中識別出Y染色體基因序列證實存在胎兒cfDNA，則可驗證檢測結果。若為女嬰，可使用胎兒單核苷酸多態(tài)性檢測明確樣本中是否存在胎兒cfDNA[6]。也有報道將超甲基化RASSF1A啟動子作為確定存在胎兒DNA的普遍胎兒標志物[32]。假陽性結果已歸因于胎兒攜帶了遺傳自母親的RhD假基因或其他基因變異[33]。此種情況下，RhD基因10個外顯子均存在，但因外顯子3、4之間的內含子中含有一個終止密碼子而阻斷翻譯過程，即表現(xiàn)為血清學RhD陰性。使用針對RhD基因外顯子4和10的引物進行檢測，通?？梢詸z測到RhD假基因。若未發(fā)現(xiàn)為假陽性，可能會導致采取不必要的有創(chuàng)性干預措施。若懷疑有RhD假基因存在，cfDNA的檢測結果將歸為“不確定”，推薦采用羊膜腔穿刺術采集羊水細胞檢測胎兒DNA，同時采集父母血液進行實驗室分析。

相較于假陽性結果，假陰性結果會更嚴重，可能因此而停止必要的監(jiān)測和干預。假陰性結果可由于在妊娠期過早(妊娠<8周)采集母體樣本，導致樣本中胎兒cfDNA水平較低，或由于實驗室檢查技術敏感性低。應對一個以上的RhD區(qū)域進行檢查，以確保陰性結果真實性，且不存在RhD的變異。目前認為cfDNA假陰性率很低，因此cfDNA提示胎兒為RhD陰性時，不會開展連續(xù)滴度測定。且分娩后通過臍帶血樣本直接Coombs試驗即可發(fā)現(xiàn)假陰性結果。一項對cfDNA用于RhD檢測研究的meta分析顯示，在妊娠第一和第二階段，cfDNA檢測RhD的敏感性為99.3%(95%CI 98.2～99.7)，特異性為98.4%(95%CI 96.4～99.3)[34]。目前一些國家胎兒RhD分型已經成為產前檢查的常規(guī)項目[35]。國內也報道了使用MALDi-TOF質譜技術、實時熒光定量PCR技術檢測預測胎兒RhD基因型無創(chuàng)產前檢測胎兒RhD血型的方法[36-37]。

高通量測序技術可以一次對幾十萬到幾百萬條 DNA 分子進行序列測定，也稱其為下一代測序技術(NGS)，使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。應用高通量測序技術檢測疾病的遺傳學特征已經成為當前精準醫(yī)學的重要組成部分。當面對復雜的疾病，傳統(tǒng)的Sanger測序、PCR、DNA 印記雜交等技術已經不能滿足臨床需求，而NGS技術最大的優(yōu)勢是索取樣本量小、成本低，為疾病的遺傳學篩查與診斷提供了便捷的途徑，在微生物的鑒定、藥物的靶向治療以及產前篩查等多個領域具有潛在的應用優(yōu)勢[38]。

英國是最早將無創(chuàng)胎兒RhD檢測技術用于臨床的國家，使用的技術包括RT-PCR和目標序列捕獲的高通量測序技術。2016年12月英國國家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化研究所(NICE)發(fā)布胎兒RhD基因型高通量無創(chuàng)產前檢測指南[39]，指出8項歐洲國家前瞻性研究報道高通量NIPT對胎兒RhD基因型的診斷準確性，其中6項研究被認為是低偏倚風險，廣泛適用于在英國全國范圍內使用高通量NIPT檢測胎兒RhD基因型。

如果胎兒是Rh陰性，母親沒有額外的紅細胞抗體，則不會有胎兒和新生兒溶血性疾病的風險，無需進一步監(jiān)測母體或胎兒溶血。使抗-D免疫球蛋白的應用更具有針對性，可將不必要的抗-D免疫球蛋白注射降低至2%。如果胎兒是Rh陽性，則需要監(jiān)測間接Coombs滴度，達到臨界滴度后監(jiān)測MCA-PSV。如果胎兒是Rh陰性，但母親有額外的抗體(如抗c或抗e)，也需要監(jiān)測胎兒溶血及母親間接Coombs滴度和MCA-PSV。通過高通量測序技術進行胎兒Rh血型檢測，指導Rh陰性孕婦孕期管理，對于存在母兒血型不合風險者加強管理，應用預防性治療。對于不存在母兒血型不合的情況也可立即確診，避免不必要的動態(tài)觀察及預防性治療，消除孕婦的精神負擔與經濟損失。

3 母兒Rh血型不合的治療

若孕期監(jiān)測MCA-PSV>1.5MoMs,可以通過臍血穿刺獲得胎兒血液測定血紅蛋白，若胎兒血紅蛋白低于平均值兩個標準差以上，則需宮內胎兒輸血治療。紅細胞壓積<30%也可作為胎兒輸血的閾值[40]。如果血紅蛋白高于這個閾值，應1～2周內再次檢測。輸血前應檢查胎兒血紅蛋白水平，因為較高的MCA-PSV并不能作為臨床顯著胎兒貧血的確切證據(jù)，可能會出現(xiàn)假陽性情況[21-22]。血紅蛋白水平降低時適當輸血比等到發(fā)生嚴重貧血(血紅蛋白缺乏癥:比正常胎齡低7g/dl[16])或水腫(血紅蛋白<5g/dl)[21]時，胎兒預后更好。

宮內輸血一般僅限于妊娠18～35周的孕婦，因為在18周之前，胎兒解剖結構較小，對操作技術挑戰(zhàn)極大。對于有既往妊娠受累史且極早發(fā)生重度同種異體免疫的罕見患者而言，可在妊娠20周前進行胎兒宮內輸血，但該做法在水腫胎兒中的成功率較低。

美國血漿置換學會關于使用治療性血漿分離置換的指南中提出，宮內輸血是目前的主要治療方法，而血漿置換和靜脈用IgG可以使胎兒血細胞比容維持在高于危及生命的水平，且維持時間長，從而可維持到在技術上可實現(xiàn)宮內血管內輸血的胎齡。如果妊娠20周前有胎兒死亡的高風險或胎兒水腫的征象，可能需要進行IVIG和/或治療性血漿置換[41]。

隨著宮內輸血的應用，嚴重胎兒貧血引起的圍產期死亡率已下降至 10%以下[42]。出生后新生兒溶血病的治療主要以光療和換血療法為主，以預防高膽紅素血癥引起的核黃疸。其他近期并發(fā)癥還包括新生兒貧血，血小板減少，膽汁淤積和呼吸系統(tǒng)疾病。多次進行宮內輸血的新生兒在出生后往往缺乏網織紅細胞，因輸入血的紅細胞主要含成人型血紅蛋白。所以，這些新生兒又會出現(xiàn)貧血，需要在出生后的幾周內追加輸血。

4 分娩時機及圍術期準備

妊娠35周之后，宮內輸血被認為比產后輸血治療更危險[43]。因此，在妊娠≥35周，MCA-PSV>1.50MoMs時，可以選擇終止妊娠。但目前缺乏關于有貧血風險胎兒或因貧血接受宮內治療胎兒分娩最佳時機的高質量研究。一方面需要權衡死胎、胎兒貧血后果和再次采血或宮內輸血等風險，同時預防早產引起的未成熟兒、貧血加重和高膽紅素血癥，專家建議孕37～38孕周計劃分娩[42]。因此，大多數(shù)臨床醫(yī)生進行最后一次胎兒采血和輸血的時間不晚于孕34～35周。

分娩無貧血或輕中度貧血的胎兒是母兒血型不合臨床管理的目標。分娩前應充分做好準備，選擇分娩方式，積極聯(lián)系新生兒科，血庫等。分娩時新生兒科的盡早介入，做好輸血準備，若無法經陰道分娩應行剖宮產術終止妊娠。