張瑀琪，蘇玉銘，王芷晴，劉海月，李欣南，于麗玲，李 寧，戴成杰，李 冰，周鐵忠，劉英姿*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；2.大石橋市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事務(wù)中心，遼寧大石橋 115100；3.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧沈陽(yáng) 110032；4.瓦房店市動(dòng)物疫病防控中心，遼寧大連 116300；5.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110032；6.朝陽(yáng)縣畜牧技術(shù)推廣站，遼寧朝陽(yáng) 122000）

鵝大腸桿菌病是由大腸埃希菌（Escherichia coil）致病菌株引起的臨床常見(jiàn)鵝細(xì)菌病之一,主要表現(xiàn)局部或全身癥狀，不同日齡不同型病例表現(xiàn)不同，常見(jiàn)有孵化中死胚、卵黃性腹膜炎、敗血癥等，由垂直傳播或經(jīng)消化道、呼吸道等多種渠道感染，一年四季均可發(fā)生[1]。近年來(lái)，養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖密度提高，鵝大腸桿菌病發(fā)病率及死亡率逐年上升。因抗生素的濫用，鵝大腸桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，為臨床治療帶來(lái)困難，造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失[2]。本試驗(yàn)以遼寧省黑山縣某發(fā)病鵝場(chǎng)作為研究對(duì)象，進(jìn)行鵝致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，為鵝大腸桿菌病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2020年7月10日遼寧省黑山縣某鵝場(chǎng)15日齡雛鵝及180 日齡雌鵝發(fā)病。該場(chǎng)飼有東北小白鵝6 000 只。雛鵝發(fā)病率35%，死亡率29%。雛鵝表現(xiàn)精神沉郁、排灰白色稀糞、眼結(jié)膜潮紅、頭面部腫脹；剖檢可見(jiàn)腹水、氣囊混濁、包心包肝、多臟器粘連等。產(chǎn)蛋鵝產(chǎn)蛋率下降50%，表現(xiàn)厭食、精神沉郁；剖檢可見(jiàn)卵黃性腹膜炎。選取具有典型癥狀病鵝4 只，無(wú)菌采集8 份病料，冷藏箱保存，24 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 試劑及動(dòng)物

試劑：微量生化反應(yīng)管（杭州天和微生物試劑有限公司）、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）

動(dòng)物：20日齡體重（20±2）g SPF級(jí)昆明小鼠50只，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng)、純化及鏡檢

無(wú)菌條件下，將病料接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，挑取優(yōu)勢(shì)菌落，再次接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。革蘭氏染色陰性短小桿菌的純菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取適量單菌落于磁珠凍存管凍存。

1.3.2 生化試驗(yàn)

取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的疑似菌落接種于微量生化反應(yīng)管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 血清學(xué)鑒定

這時(shí)的常愛(ài)蘭什么也聽(tīng)不進(jìn)去，但打孩子的動(dòng)作總算是停了，馱子么在一邊不停地嘆著氣，唉，真丟人真丟人。他拿過(guò)一張又一張桌上的紙，直看得面紅耳赤，這種面紅耳赤就跟老樟樹(shù)下周大毛他們?nèi)⌒λ麜r(shí)一模一樣。

將分離菌株培養(yǎng)物用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水沖洗制成菌懸液，121 ℃高壓1 h破壞抗原。將高壓抗原與單因子血清做平板凝集試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

1.3.4 分子生物學(xué)檢測(cè)

按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取分離菌的基因組DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板，使用16S rRNA通用引物擴(kuò)增，目的片段為1 450 bp。PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳，使用膠收試劑盒回收目的條帶測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果并分析。

表1 PCR反應(yīng)體系Tab.1 PCR reaction system

1.3.5 致病性試驗(yàn)

1.3.5.1 菌液的制備

將分離株于肉湯培養(yǎng)基復(fù)蘇。用無(wú)菌PBS 溶液洗滌3次后，每管加入500 μL無(wú)菌PBS溶液制成菌懸液備用。

1.3.5.2 小鼠致病性試驗(yàn)

表2 小鼠分組及處理方法Tab.2 Group and treatment methods of mice

1.3.6 藥敏試驗(yàn)

參考《2019 年動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)計(jì)劃》附件6，選取14 種抗生素進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離培養(yǎng)結(jié)果（見(jiàn)圖1～圖4）

8份病料樣品，均有菌落生長(zhǎng)。由圖1～圖4可知，分離株在普通瓊脂培養(yǎng)基為圓潤(rùn)半透明灰白色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上為邊緣整齊的中等大小濕潤(rùn)粉紅色菌落；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基形成黑色或黑紫色有明顯金屬光澤中等大小菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)，G-，單個(gè)存在短小桿菌。以上特征符合大腸桿菌形態(tài)特征。

圖1 普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Training result of common agar medium

2.2 菌株生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

由表3可知，選取8株分離株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果與大腸桿菌生化特點(diǎn)相符。

2.3 菌株血清學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定，其中O883 株、O1712 株、O592株、O271株。

圖2 麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Training result of McConkey medium

圖3 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果Fig.3 Training result of eosin methylene blue medium

圖4 大腸桿菌革蘭氏染色特征Fig.4 Gram staining characteristics of Escherichia coli

表3 菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Biochemical test results of strain

2.4 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖5）

由圖5可知，經(jīng)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳，得到1 450 bp目的條帶，序列經(jīng)NCBI 中Blast 在線比對(duì)，與大腸桿菌的同源性高于99%，確定其為大腸桿菌。

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4、圖6～圖8）

由表4可知，各血清型選取1株代表菌株，進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn)，4 組感染組小鼠發(fā)病率為92.5%，死亡率為87.5%，細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性率均為100%。

由圖6、圖7可知，發(fā)病小鼠精神沉郁、腹部膨脹、口鼻發(fā)紺。由圖8可知，剖檢可見(jiàn)腹腔有纖維素滲出、肝臟腫大有瘀血斑、表面附著纖維素偽膜、脾臟暗紅腫大、心外膜出血、腎臟腫大有出血點(diǎn)。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表5）

各血清型選取1株代表菌株，進(jìn)行14種藥物敏感性試驗(yàn)。由表5 可知，本次選取的4 株致病性大腸桿菌對(duì)甲氧芐啶、磺胺異惡唑敏感，對(duì)黏桿菌素、美羅塔南、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢他啶、頭孢噻呋、氟苯尼考、四環(huán)素、大觀霉素、慶大霉素、氨芐西林耐藥。

圖5 16S rRNA PCR鑒定結(jié)果Fig.5 16S rRNA PCR results

圖6 發(fā)病小鼠精神沉郁、口鼻發(fā)紺Fig.6 Depression and cyanosis of mouth and nose in mice

圖7 病死小鼠腹部膨脹Fig.7 Abdominal distention in dead mice

表4 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of pathogenicity test in mice

圖8 小鼠剖檢變化Fig.8 The changes of mice autopsy

3 討論

鵝大腸桿菌病病型復(fù)雜多變，常見(jiàn)有死胚、敗血癥、卵黃性腹膜炎、腦膜炎等[3]。本研究對(duì)遼寧省黑山縣某大型發(fā)病鵝場(chǎng)進(jìn)行病例觀察和病原菌分離鑒定，確認(rèn)為鵝大腸桿菌病。雛鵝主要表現(xiàn)為漿液纖維素性漿膜炎，成年鵝為卵黃性腹膜炎。此前，東北地區(qū)已有多個(gè)鵝場(chǎng)出現(xiàn)鵝致病性大腸桿菌感染發(fā)病，證明本病發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重[4-7]。

大腸桿菌血清型眾多且不同血清型間交叉保護(hù)力低，所以需對(duì)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)血清型進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合相應(yīng)血清型疫苗預(yù)防才能達(dá)到理想效果[8]。趙陽(yáng)[9]于黑龍江省分離的鵝致病性大腸桿菌血清型為：O9、O18、O64、O93。本研究分離的黑山地區(qū)鵝致病性大腸桿菌血清型為：O88、O171、O59、O27，證明不同地區(qū)大腸桿菌血清型具有差異。小鼠致病性試驗(yàn)證明：O171致病性最強(qiáng)，死亡率高達(dá)100%，其他血清型也具有較強(qiáng)致病性。

表5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of drug sensitivity

2017 年，王春蓮等[10]關(guān)于承德地區(qū)鵝致病性大腸桿菌的研究中，分離株對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率也高達(dá)100%。本研究中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，黑山地區(qū)分離株對(duì)黏桿菌素、美羅塔南等11 種抗生素嚴(yán)重耐藥。各地區(qū)鵝致病性大腸桿菌已產(chǎn)生較強(qiáng)耐藥性且有地區(qū)差異[11-13]。因此，科學(xué)應(yīng)用敏感藥物對(duì)鵝大腸桿菌病進(jìn)行防治才能達(dá)到理想效果。

4 結(jié)論

從遼寧省黑山縣某發(fā)病鵝場(chǎng)分離鑒定4 種血清型大腸桿菌，分別為O88、O171、O59、O27。所分離的鵝大腸桿菌是有較強(qiáng)致病性和耐藥性，建議選取敏感藥物甲氧芐啶、磺胺異惡唑?qū)Z大腸桿菌病進(jìn)行防治或開(kāi)發(fā)相應(yīng)血清型疫苗進(jìn)行免疫防控。