林留霞，桂成坤，李蓮瑞，2*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

綿羊無(wú)漿體病是在綿羊和山羊體內(nèi)由專(zhuān)性寄生的蜱傳性的血液傳染病，舊稱(chēng)邊蟲(chóng)病[1-2]，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)也有少量分布[3]。1983年，馬玉良等[4]首次在新疆發(fā)現(xiàn)綿羊無(wú)漿體感染，隨后遼寧、內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、寧夏、青海、河南、山東、四川等地區(qū)[5-9]相繼出現(xiàn)綿羊無(wú)漿體的報(bào)道。該病主要破壞動(dòng)物的紅細(xì)胞，綿羊感染該病后出現(xiàn)消瘦、貧血、黃疸等臨床癥狀，造成生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、料重比增高、急性感染時(shí)甚至?xí)?dǎo)致動(dòng)物死亡[10]。目前，基層地區(qū)檢測(cè)綿羊無(wú)漿體病的主要方法有吉姆薩染色法，但吉姆薩染色法只能在動(dòng)物感染后16～22 d 檢出蟲(chóng)體，檢出率低。因此，本試驗(yàn)采用巢式PCR 法，通過(guò)MSP4基因和16S rRNA 基因設(shè)計(jì)并合成引物，進(jìn)行無(wú)漿體病感病率檢測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)而為南疆地區(qū)綿羊無(wú)漿體病的防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對(duì)南疆4個(gè)地區(qū)637只綿羊進(jìn)行一次性無(wú)菌頸靜脈采血并編號(hào)，保存于4 ℃恒溫箱中備用。陽(yáng)性樣品由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。南疆4地區(qū)采樣地點(diǎn)分布及采樣數(shù)量見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

試劑：Gold view 染料購(gòu)自蘇區(qū)金唯智生物科技有限公司；d NTP Mixture 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000 Marker購(gòu)自北京華大生物科技有限公司；Agarose購(gòu)自北京沃比森科技有限公司；全血DNA 快速提取試劑盒購(gòu)自北京華大生物科技有限公司。

儀器：SW-CJ-2F 凈化工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）、5415R 小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司）、Vortex Geni2 渦旋混合器（Sciectific Industries 公司）、HVE-50 高壓滅菌鍋（HIPAYAMA 公司）、Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽（北京六一儀器廠(chǎng)）、GEL DOC XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司），TProfessional PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊全血DNA的提取和巢式PCR擴(kuò)增

按北京華大生物科技有限公司生產(chǎn)的全血DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取羊全血DNA。參照王貴強(qiáng)[11]設(shè)計(jì)的引物序列進(jìn)行試驗(yàn)。其中，特異性引物由北京華大基因公司合成。羊無(wú)漿體引物序列見(jiàn)表2。

表1 綿羊血液樣品統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Sheep blood sample statistics table

表2 綿羊無(wú)漿體引物序列Tab.2 Anaplasma ovis primer sequence

巢式PCR 反應(yīng)體系為：DNA 模板1 μL、上游引物AO1/AO3 和下游引物AO2/AO4 各0.3 μL、dNTP Mixture 12.5 μL、加入10.9 μLddH2O 補(bǔ)足至25 μL 體系。第1 輪PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸反應(yīng)10 min。第2輪PCR擴(kuò)增程序預(yù)變性、變性、退火及延伸等后續(xù)步驟與第1 輪PCR 程序相同（變性至延伸過(guò)程重復(fù)35個(gè)循環(huán)）。

1.3.2 巢式PCR產(chǎn)物檢測(cè)

綿羊無(wú)漿體巢式PCR 產(chǎn)物檢測(cè)是將第1 套引物擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋20倍，取1 μL作第2套引物擴(kuò)增的模板，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后對(duì)PCR 結(jié)果進(jìn)行1%Agrose 電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 感染情況統(tǒng)計(jì)

巢式PCR擴(kuò)增出目的條帶584 bp的樣品為陽(yáng)性樣品，表示綿羊感染綿羊無(wú)漿體，統(tǒng)計(jì)4個(gè)地區(qū)綿羊無(wú)漿體感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 巢式PCR檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖1）

將綿羊無(wú)漿體（A.ovis）PCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳，得到22 份樣品的PCR 1%Agrose 電泳檢測(cè)結(jié)果。由圖1 可知，本試驗(yàn)得到的綿羊無(wú)漿體的目的條帶大小為584 bp，PCR結(jié)果與理論分子量一致。注：M 為DL2000；N 為陰性對(duì)照；P為陽(yáng)性對(duì)照；1～22為部分樣品A.ovis檢測(cè)結(jié)果。

2.2 感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見(jiàn)表3、圖2、圖3）

由表3可知，喀什地區(qū)的巴楚縣感染率高達(dá)91.4%，是21個(gè)縣市中最高的，與于心等[12]對(duì)塔里木盆地地區(qū)蜱的分布情況相吻合，調(diào)查結(jié)果顯示巴楚地區(qū)亞?wèn)|璃眼蜱、短小扇頭蜱和銀盾革蜱均有分布且是優(yōu)勢(shì)種，優(yōu)勢(shì)蜱的廣泛分布加劇了綿羊無(wú)漿體的分布。根據(jù)卡方檢驗(yàn)，南疆4個(gè)地區(qū)的平均感染率差異極顯著（χ2=26.914，P＜0.001）。巴州地區(qū)總體感染率為75.8%，是感染率最高的地區(qū)，與張玉婷等[13]調(diào)查巴州地區(qū)羊體表寄生的優(yōu)勢(shì)種革蜱情況相符。其余3地州各地區(qū)綿羊感染綿羊無(wú)漿體情況雖有不同但差距不大。

圖1 綿羊全血部分樣品的綿羊無(wú)漿體PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Anaplasma ovis PCR detection results of some samples of sheep whole blood

表3 南疆4地區(qū)無(wú)漿體病感染率Tab.3 Infection rate of Anaplasma ovis in four areas of southern Xinjiang

圖2 南疆4地區(qū)無(wú)漿體病感染率誤差圖Fig.2 Error map of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang

圖3 南疆4地區(qū)無(wú)漿體病感染率Fig.3 Infection rate of Anaplasma ovis infection rate in four areas of Southern Xinjiang

由圖2 可知，南疆4 地區(qū)各縣市無(wú)漿體感染率在11.4%～91.4%范圍內(nèi)，其中阿克蘇地區(qū)和和田地區(qū)感染率略低于南疆四地區(qū)平均值；喀什地區(qū)則略高于平均值；巴區(qū)地區(qū)明顯高于4地區(qū)感染率平均值；各地區(qū)差異較大。

由圖3 可知，南疆4 地區(qū)無(wú)漿體病感染率由高到低為巴區(qū)地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)、阿克蘇地區(qū)，其中和田與阿克蘇地區(qū)感染率較為接近，同為南疆四地區(qū)較低水平；喀什地區(qū)各縣市無(wú)漿體病感染率差異最大，感染率最低的喀什市，最高的是巴楚縣，相差7.3倍。

3 討論

無(wú)漿體?。╝naplasmosis）的傳播途徑包括生物性傳播、機(jī)械性傳播和胎盤(pán)傳播，其中蜱的生物性傳播是最主要最有效的傳播方式[14]。1990年，呂文順等[15]通過(guò)傳播試驗(yàn)確定亞?wèn)|璃眼蜱、草原革蜱和短小扇頭蜱是傳播綿羊無(wú)漿體的媒介蜱。2018年，聞秀秀等[16]通過(guò)PCR檢測(cè)和同源性分析確定銀盾革蜱和邊緣革蜱也是綿羊無(wú)漿體的媒介蜱。代艷艷等[17]對(duì)南疆地區(qū)牛羊蜱的調(diào)查結(jié)果顯示，扇頭蜱屬和璃眼蜱屬是南疆地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱屬，且南疆各地均有分布。因此，綿羊無(wú)漿體的感染情況和分布情況與蜱的分布直接相關(guān)，與本次調(diào)查結(jié)果相符。

曲久等[18]調(diào)查西藏西北羌塘草原部分地區(qū)山羊的綿羊無(wú)漿體感染率為10.4%。張文靜等[19]對(duì)中國(guó)陜西、云南、河南共12個(gè)縣區(qū)奶山羊血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，綿羊無(wú)漿體總陽(yáng)性率為23.0%。Liu 等[20]對(duì)我國(guó)中南部綿羊無(wú)漿體進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，感病率為73.9%。孫明等[21]對(duì)甘肅省景泰縣羊無(wú)漿體病感染率進(jìn)行調(diào)查，感病率為30.6%。黃毓蘭等[22]對(duì)云南省種羊繁育推廣中心羊只進(jìn)行無(wú)漿體檢測(cè)的感病率達(dá)44.4%。南疆4 地區(qū)無(wú)漿體病平均感病率為33.3%，處于中國(guó)中間水平。上述研究表明，綿羊無(wú)漿體病感病率差異性較大，與飼養(yǎng)方式、飼養(yǎng)環(huán)境等因素關(guān)聯(lián)性較大。

近年來(lái)，南疆地區(qū)畜牧業(yè)迅速發(fā)展，但飼養(yǎng)方式落后，多為“放牧+補(bǔ)飼”和“放牧+舍飼”[23]。在野外放牧條件下羊群易被蜱叮咬，這種落后的飼養(yǎng)方式造成南疆地區(qū)綿羊無(wú)漿體病的廣泛分布。該病可致病羊日漸消瘦、生產(chǎn)性能下降，混合感染或繼發(fā)感染更會(huì)導(dǎo)致死亡率增加[22]，嚴(yán)重影響綿羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。該病的防治應(yīng)防重于治，即控制媒介蜱。可采取輪換放牧和藥物滅蜱聯(lián)合進(jìn)行達(dá)到控蜱滅蜱的目的。同時(shí)，應(yīng)改變傳統(tǒng)的放牧模式，集中科學(xué)飼養(yǎng)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，巴區(qū)、喀什、和田和阿克蘇地區(qū)的感染率分別為75.8%、34.8%、23.3% 和23.0%，平均感染率為33.3%，說(shuō)明新疆南疆地區(qū)屬于綿羊無(wú)漿體病高發(fā)地區(qū)需要加大防控力度。