劉 歡，郭 伶

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

奶牛乳房炎是一種嚴(yán)重危害乳品行業(yè)并普遍發(fā)生的疾病，在美國的發(fā)病率為40%，在中國的發(fā)病率高達(dá)60%～70%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在中國，每年因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30 億元[3]，乳房炎的發(fā)病情況更嚴(yán)重[4-5]。奶牛乳房炎是由于乳腺發(fā)生外傷、感染等因素而導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，在飼養(yǎng)奶牛的過程中非常容易發(fā)病，并且藥物治療成本較高，屬于較難進(jìn)行防治和診斷的疾病之一，嚴(yán)重威脅著我國的動(dòng)物性食品安全[6]。臨床上造成奶牛乳房炎的因素復(fù)雜多樣。乳房炎引起牛奶品質(zhì)下降，降低奶牛產(chǎn)奶的性能，進(jìn)而導(dǎo)致出現(xiàn)棄奶、藥物治療的費(fèi)用也會(huì)隨之增加，影響?zhàn)B殖效益。因此，必須對奶牛乳房炎的病原菌的分離鑒定采取措施，盡可能減少經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。文章對奶牛乳房炎的病原菌的分離鑒定進(jìn)行研究，為乳房炎中病原菌的分離鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

吊菌環(huán)、顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、培養(yǎng)皿、滅菌試管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

乳房炎奶樣采自遼寧某奶牛場。首先用溫水清洗患區(qū)，用酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒，棄去頭2把乳。以無菌操作的方法將適量乳汁擠入滅菌試管中,并將乳樣擠在瓊脂斜面上，并做好標(biāo)記。采集的樣品冷藏保存，并盡快分離細(xì)菌。臨床型乳房炎判定標(biāo)準(zhǔn)：乳房有明顯的炎癥癥狀、乳區(qū)出現(xiàn)紅腫熱痛、擠奶時(shí)奶牛抗拒、擠出的奶樣中有絮狀沉淀或顏色變化[9]。

1.2.2 細(xì)菌分離

充分搖勻采集的無菌奶樣，分別劃線接種于普通瓊脂平板、胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板、腦心浸液瓊脂平板和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基接種劃線，做好標(biāo)記，置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h然后進(jìn)行觀察。

1.2.3 細(xì)菌涂片、染色、鏡檢

使用接種環(huán)取少量蒸餾水，放在載玻片的中央，選擇少量可疑菌落與蒸餾水中混合均勻，干燥后進(jìn)行火焰固定。進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。根據(jù)菌體形態(tài)、溶血情況及染色特性初步判斷細(xì)菌類別，并進(jìn)一步純化和培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

選擇疑似大腸桿菌，鏈球菌和金黃色葡萄球菌的菌落涂片，革蘭染色，鏡檢觀察染色特性、形態(tài)和菌體排列。革蘭染色鏡檢可見到在顯微鏡下呈兩端鈍圓的淡紅色短桿菌[10]，初步判斷為大腸桿菌；可見單一、成對或成鏈的革蘭氏陽性細(xì)菌，初步判斷為鏈球菌；還可見呈革蘭氏陽性葡萄串狀球菌存在，初步判斷為金黃色葡萄球菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中的生長結(jié)果（見表1）

表1 細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中的生長結(jié)果Tab.1 Bacteria growth results in various media

由表1 可知，金黃色葡萄球菌在營養(yǎng)瓊脂上生長為圓形、光滑、略微凸起的中等大小菌落；在腦心浸液培養(yǎng)基上生長為圓形、中等大小菌落；而在麥康凱瓊脂和胰蛋白胨大豆肉湯上則不生長。鏈球菌在營養(yǎng)瓊脂上生長不良；在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中生長良好；而在麥康凱瓊脂和腦心浸液培養(yǎng)基中不生長。大腸桿菌在營養(yǎng)瓊脂上生長為灰白色露珠樣、凸起、邊緣光滑整齊的菌落；在麥康凱瓊脂上生長為中等大小的紅色菌落；而在胰蛋白胨大豆肉湯和腦心浸液培養(yǎng)基上不生長。

2.2 細(xì)菌在培養(yǎng)基中的形態(tài)觀察（見圖1～圖3）

圖1 金黃色葡萄球菌生長狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Growth status and morphological structure of Staphylococcus aureus

圖2 鏈球菌生長狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Growth status and morphological structure of Streptococcus

由圖1～圖3 可知，金黃色葡萄球菌革蘭染色陽性球菌，呈葡萄狀排列；鏈球菌為革蘭氏陽性球菌、無芽孢、無莢膜、菌體呈鏈狀排列；大腸桿菌為革蘭染色陰性桿菌、兩端鈍圓，呈紅色或粉紅色、無芽孢、無莢膜。

圖3 大腸桿菌生長狀態(tài)和形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.3 Growth status and morphological structure of E.coli

2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定（見圖4）

圖4 分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of isolated strains

由圖4可知，分別用大腸桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌的引物擴(kuò)增該分離菌DNA 后獲得大小約為1 262、689和420 bp 左右的目的片段，與大腸桿菌引物、鏈球菌引物和金黃色葡萄球菌特異性引物預(yù)期片段大小一致，并且空白對照組無目的片段出現(xiàn)。

3 討論

此次共采集乳樣26份，24份分離出病原菌，分離率達(dá)到92.3%，單一菌感染占76.5%，混合感染占15.8%。對病原菌的分離鑒定可知，引起奶牛乳房炎的病原菌種類繁多并且還與地域、環(huán)境等因素密切相關(guān)。其主要致病菌是大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌。

本次分離結(jié)果以大腸桿菌為主，其次是葡萄球菌和鏈球菌。細(xì)菌的分離和鑒定是乳房炎防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。乳房炎仍然是乳制品生產(chǎn)中最常見和最嚴(yán)重的疾病之一，對乳制品生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，甚至對改善牛奶質(zhì)量具有重大意義。消費(fèi)者對于牛奶的質(zhì)量要求越來越高，改善牛奶質(zhì)量防治乳房炎已經(jīng)成為研究人員普遍關(guān)注的問題。奶牛乳房炎是一種感染性疾病[11]。引起乳房炎的因素有很多，主要原因是病原微生物[12]。由于地理環(huán)境、飼養(yǎng)管理水平、常用抗菌藥物等方面的影響，不同地理區(qū)域甚至同一地區(qū)不同牛場奶牛乳房炎病原菌的流行情況差異也很大[13]。隨著人民對物質(zhì)生活水平要求的提高，對乳品的需求大大增加，奶牛養(yǎng)殖量也逐年提升，為促進(jìn)奶牛產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對乳房炎的綜合防治和研究。

4 結(jié)論

共采集26 份樣品分離出17 個(gè)菌株，其中大腸桿菌10 株，葡萄球菌5 株，鏈球菌2 株，可知養(yǎng)殖場奶牛乳房炎是由多種病原菌引起的。