楊雪瓊，陳錫嬌，高玉芳，周熠炯，張璽威，陳劍濤，陳 鑫

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）是我國院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一，近年來在院內(nèi)感染中的檢出率不斷上升[1]，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CARSS）最新數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌的臨床分離率位居第3，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。隨著抗菌藥物的廣泛使用特別是濫用，銅綠假單胞菌的耐藥問題日趨嚴(yán)重，耐藥菌株不斷出現(xiàn)而且多呈多重耐藥性，而多重耐藥銅綠假單胞菌（Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa，MDRPA）常與全球流行病暴發(fā)有關(guān)，可導(dǎo)致很高的發(fā)病率和死亡率[2]，給臨床治療MDRPA感染帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，本研究對從佛山市某大型三甲綜合醫(yī)院收集后篩選得到的MDRPA菌株進(jìn)行耐藥特性分析，以期為臨床治療MDRPA感染提供用藥參考依據(jù)。

此外，大量研究報道中藥在治療細(xì)菌感染方面有其獨特的作用，且具有不易產(chǎn)生耐藥、毒副作用小、資源豐富等優(yōu)勢[3]；另外臨床抗感染經(jīng)驗表明，單一用藥對銅綠假單胞菌的治療并不理想，容易產(chǎn)生耐藥，許多權(quán)威機(jī)構(gòu)主張聯(lián)合用藥。因此，本研究在研究耐藥機(jī)制的同時，從20種清熱解毒中藥中篩選對MDRPA具有體外抗菌活性的中藥并進(jìn)行聯(lián)合用藥研究，以獲得最佳的中藥聯(lián)用組合，為中藥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考的同時為臨床治療MDRPA感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株

從佛山市某大型三甲綜合醫(yī)院的臨床檢驗科收集50株臨床分離的銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌（ATCC27853）為質(zhì)控菌株（購于國家衛(wèi)生健康委員會臨檢中心）。

1.2 藥物與試劑

黃連、半枝蓮、金銀花、射干、大葉青、赤芍、蒲公英、白花蛇舌草、板藍(lán)根、魚腥草、決明子、知母、黃芩、夏枯草、梔子、牡丹皮、蘆根、生地黃、石膏、菊花（購于青島醫(yī)保城醫(yī)藥公司）；營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉（購于青島海博生物）；氨基糖苷修飾酶、碳青霉烯酶等引物，DNA染色劑、瓊脂糖、Premix Taq（購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；抗生素藥敏紙片（購于杭州微生物試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

智能恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋（購于廣州科曉科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（購于廣州沃霖實驗室設(shè)備有限公司）；PCR儀（購于美國Bio-Rad公司）；電泳儀（購于六一生物科技有限公司）；凝膠紫外成像分析儀（購于上海嘉鵬科技有限公司）；微量移液器和多道移液器（購于梅特勒—托利多國際有限公司）；酶標(biāo)儀、微型離心管（EP管）、96孔聚苯乙烯板、一次性培養(yǎng)皿等（購于廣州步前生物科技有限公司）；Eppendorf離心機(jī)（購于艾本德中國有限公司）。

1.4 銅綠假單胞菌藥敏試驗

采用藥敏紙片法（K-B法）對臨床分離的50株銅綠假單胞菌進(jìn)行初篩。操作如下：（1）菌液準(zhǔn)備：將收集來自-80℃冰箱的銅綠假單胞菌菌株取出，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板進(jìn)行復(fù)蘇，連續(xù)傳兩代（細(xì)菌狀態(tài)穩(wěn)定）后取對數(shù)生長期的細(xì)菌菌落2～4個（約1 mm）混于2～3 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?；?）接種及貼藥：取350 μl上述菌懸液均勻涂布于MH肉湯培養(yǎng)基平板，15 min內(nèi)間隔一定距離貼上抗生素藥敏紙片；（3）培養(yǎng)：37℃溫箱培養(yǎng) 16～18 h；（4）結(jié)果判定：讀取并記錄培養(yǎng)后MH平板上抗生素藥敏紙片周圍的抑菌圈，對照CLSI標(biāo)準(zhǔn)得出相應(yīng)抗生素對菌株的抑菌效果，從而篩選出MDRPA[4]。

1.5 耐藥機(jī)制研究——耐藥基因檢測

（1）聚合酶鏈反應(yīng)：①制備模板：取4～6個菌落（約1 mm）于 100 μl雙蒸水（ddH2O）中，100℃煮沸 10 min，再以 14 000 rpm離心5 min，上清液即可作為模板。

②引物處理：氨基糖苷修飾酶基因[包括rmtB、an（t2”）-I、armA、aac（3）-Ib、rmtA、aac（6”）-II）、金屬 β- 內(nèi)酰胺酶基因（包括 blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaSIM、blaGIM]、苯唑西林酶（blaOXA-2、blaOXA-10）引物是通過指導(dǎo)教師協(xié)助查閱NCBI網(wǎng)站基因序列而設(shè)計的，并委托上海生工生物工程有限公司合成。合成后的引物按照說明加相應(yīng)的無菌ddH2O，配成100 μm的引物，稀釋 10 倍（取 10 μl加到 90 μl無菌 ddH2O中），配成濃度為10 μm 的引物。

③PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系如下（總體系10 μl）：每反應(yīng)體系含Taq 酶 5 μl、引物 F 和 R 各 0.5 μl、模板 0.8 μl和 ddH2O 3.2 μl。加樣完成后進(jìn)行94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30個周期；最后72℃延長至5 min。

（2）瓊脂糖凝膠電泳[5]：①制膠：本實驗配1.5%的瓊脂糖電泳膠，稱取1.5 g瓊脂粉溶于100 mL TAE液（Tris-乙酸-EDTA）中，100℃加熱2 min溶解，根據(jù)說明書加入相應(yīng)的DNA染色劑，將未凝固的膠倒在制膠板上，待其凝固后垂直拔起梳子。

②加樣：將擴(kuò)增的產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠中，凝膠加樣處靠近負(fù)極（黑色電極），第1個加樣孔加marker做對照，選用100bp的marker。

③電泳：接通電源，120 V電泳30 min左右，將電泳后的凝膠置于凝膠紫外成像分析儀觀察是否出現(xiàn)與目的基因大小一致的擴(kuò)增條帶，若有則表明細(xì)菌能產(chǎn)生對應(yīng)的鈍化酶。

1.6 中藥提取物的制備

采用煮沸法制備中藥提取物。取各種中藥15 g分別浸泡于250 mL超純水1 h；用砂鍋細(xì)火煮2 h，趁熱過濾、收集濾液；在殘渣中加入150 mL超純水，再煮2 h，將兩次過濾后的濾液混合，加熱濃縮至15 mL，即可得到濃度為1 000 mg/mL的中藥提取物。將制備好的藥液裝入瓶中加蓋，用高壓蒸汽滅菌鍋高壓滅菌（121℃，15 min），待冷卻后放于 4℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

1.7 微量肉湯稀釋法

微量肉湯稀釋法可測出中藥對多重耐藥銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC），從而篩選出抗菌效果較好的中藥以及有代表性的菌株進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗。

在超凈工作臺中，取無菌96孔板，先做好標(biāo)記，在第1排的第1個孔加入用MH液體培養(yǎng)基稀釋到100 mg/mL的中藥藥液200 μl，第2～11排每孔依次加入100 μl MH液體培養(yǎng)基，第12排加入200 μl。再用多道移液器從第1列中取100 μl中藥藥液至第2排孔，混勻，依此類推至第10排，棄去100 μl，以達(dá)到中藥藥液的倍比稀釋，從第1—11排每孔依次加入0.5麥?zhǔn)蠁挝挥肕H液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍的菌液100 μl，最后將96孔板密封置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。觀察結(jié)果：在陽性對照有細(xì)菌生長且陰性對照無細(xì)菌生長的前提下，小孔內(nèi)澄清無細(xì)菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度，但若細(xì)菌生長在不連續(xù)孔時，則該實驗可能是藥物混勻不當(dāng)，應(yīng)重復(fù)試驗[7]。

1.8 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗

根據(jù)微量肉湯稀釋法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)半枝蓮、夏枯草、黃芩、黃連這4種中藥對12株菌的抑制效果較為明顯并得出相應(yīng)的MIC。采用棋盤法檢測中藥的聯(lián)合作用，使用8個稀釋倍數(shù)，用中藥單用時MIC的4倍濃度作為藥物最高濃度，而后用MH培養(yǎng)基依次倍比稀釋，分別為 4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 倍MIC。倍比稀釋均在96孔板中操作，第9、10列孔分別加入A、B各不同梯度濃度的提取物作為參考，每孔各100 μl，第11列孔不加藥作為陽性對照，第12列孔不加藥不加菌作為陰性對照（加MH培養(yǎng)基）。然后在第1—11孔各加配好的實驗菌懸液100 μ（l接種菌量為1×105CFU/mL），加完后用酶標(biāo)儀測吸光值（OD），最后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育 18～24 h，培養(yǎng)完后再測OD值，觀察培養(yǎng)前后吸光度變化，得出中藥聯(lián)用后的MIC并計算其部分抑菌濃度指數(shù)（FIC=A藥聯(lián)用時MIC/A藥單用時MIC+B藥聯(lián)用時MIC/B藥單用時MIC）。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC＜1為部分協(xié)同作用，F(xiàn)IC=1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用[8]。

2 結(jié)果

2.1 藥敏紙片法結(jié)果

采用K-B法對50株銅綠假單胞菌進(jìn)行初篩得到20株MDRPA，根據(jù)CLSL標(biāo)準(zhǔn)得到20株MDRPA的耐藥情況。這些菌株對青霉素G、紅霉素、頭孢唑啉、氨芐西林的耐藥率達(dá)到了100%，對諾氟沙星的耐藥率最低（8%），對亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星的耐藥率見圖1。

圖1 20株MDRPA對抗菌藥物的耐藥情況

2.2 耐藥基因檢測結(jié)果

ant（2"）-I和bla SIM的檢出率最高，分別為100%、87%，aac（3）-Ib、aac（6”）-II、blaIMP、blaVIM、blaGIM基因未檢出，具體結(jié)果見圖2。

圖2 MDRPA常見的耐藥基因及檢出率

2.3 微量肉湯稀釋法結(jié)果

通過微量肉湯稀釋法得到的20種中藥中，黃芩（MIC：1.56～6.25 g/L）、半枝蓮（MIC：3.13～6.25 g/L）、夏枯草（MIC：3.13～25.00 g/L）、黃連（MIC：6.25～25.00 g/L）對 20 株 MDRPA中的12株的抑菌效果較好，選擇它們進(jìn)行棋盤法聯(lián)合藥敏試驗。

2.4 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果

通過微量肉湯稀釋法可得出中藥在單用和聯(lián)用時對細(xì)菌的最小抑菌濃度，結(jié)果見表1～3。從各中藥組合的棋盤法結(jié)果來看，黃芩+半枝蓮組合（具有協(xié)同作用比例為75%，部分協(xié)同作用比例為25%）與黃芩+夏枯草組合（具有協(xié)同作用比例為58%，部分協(xié)同作用比例為42%）對MRDPA的抑菌效果最好。

表1 棋盤法黃芩與半枝蓮聯(lián)用時的MIC（g/L）

表2 棋盤法黃芩與夏枯草聯(lián)用時的MIC（g/L）

表3 兩種效果較好的中藥組合的部分抑菌濃度（%）

3 討論

3.1 部分耐藥基因可編碼產(chǎn)生鈍化酶引起PA耐藥

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，PA耐藥發(fā)展迅速，對常見的抗菌劑的耐藥率不斷上升，耐藥菌株日益增加[9]。此外，銅綠假單胞菌嚴(yán)重感染者病死率高，臨床上治療普遍比較棘手。解決這個難題的關(guān)鍵在于找出細(xì)菌的耐藥機(jī)制，為臨床合理用藥提供依據(jù)。常見的細(xì)菌耐藥機(jī)制包括鈍化酶的產(chǎn)生、藥物作用靶點改變、主動外排機(jī)制、細(xì)菌生物被膜作用等。本研究在研究細(xì)菌耐藥機(jī)制中選取了相對重要的機(jī)制——鈍化酶的產(chǎn)生，大量研究發(fā)現(xiàn)，鈍化酶可以水解或修飾抗生素結(jié)構(gòu)而引起抗生素失活。（1）細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素耐藥取決于氨基糖苷修飾酶，氨基糖苷修飾酶主要有N－乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、O-核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）等，其通過共價修飾的方法使氨基糖苷類抗生素對細(xì)菌的作用效果減弱，從而導(dǎo)致耐藥[10]。本實驗中ant（2”）-I耐藥基因檢出率最高，推斷出細(xì)菌可能產(chǎn)生氨基糖苷修飾酶使慶大霉素和阿米卡星降解。（2）檢出率居其次的為bla SIM、bla SPM，有研究報道，該酶基因位于染色體或質(zhì)粒上，可通過轉(zhuǎn)座子、整合子等移動元件進(jìn)行傳播，一旦有MBL耐藥基因存在，很容易進(jìn)行水平傳播，進(jìn)而導(dǎo)致臨床中該類菌的耐藥率不斷升高[11]。（3）有研究表明，苯唑西林酶可能是因為氨甲?；?內(nèi)酰胺類抗生素的活性位點Lys-70殘基，從而產(chǎn)生耐藥[12]。

3.2 中藥聯(lián)合對MDRPA有抑菌活性

有研究顯示，中藥在治療細(xì)菌感染方面有較好的效果。結(jié)合中藥的諸多優(yōu)勢，本研究小組經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)黃芩+半枝蓮、黃芩+夏枯草這兩個中藥聯(lián)用組合抑菌活性較好，由此推斷出黃芩在與半枝蓮或夏枯草混用時可能發(fā)生某些生化機(jī)制使得藥物更好地發(fā)揮其抑菌作用，但本研究尚未深入了解，只可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

綜上，在抗菌藥物耐藥日益嚴(yán)重的形勢下，研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制的基因水平和開發(fā)新型治療方案極為重要，可為臨床合理使用抗菌藥物以及控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、變遷和傳播提供理論依據(jù)。我國中藥資源豐富，且目前中藥不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，因此未來與中藥相關(guān)的研究可能會越來越多。而本研究關(guān)于中藥聯(lián)用的抑菌活性，可為后續(xù)研究提供實驗依據(jù)并為臨床用藥提供參考。