熊海波，陳志超，曹華杰，徐慶陽,3,4*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(河南巨龍生物工程股份有限公司，河南 平頂山，467500) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)4(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，作為重要的食品添加劑，可調(diào)節(jié)食品中的氨基酸平衡[1]，強化食品的營養(yǎng)價值，同時在肝臟中不能被降解，可直接進入血液，將直接影響肝臟中血糖的水平，被用于配制特殊的治療型輸液及藥物，因而被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)，具有巨大的商業(yè)價值[2]。

L-異亮氨酸菌種改造及發(fā)酵優(yōu)化的方法很多，菌體誘變有通過常溫常壓等離子體誘變[3]、采用紫外、亞硝基胍等復(fù)合誘變手段[4-5]；菌種改造有過表達雙組份轉(zhuǎn)運系統(tǒng)BrnFE操縱子[6]、利用基因重組技術(shù)替換ilv LXGMEDA啟動子并過表達解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilv A和ilv IH等方法[7-8]；發(fā)酵優(yōu)化有對培養(yǎng)基成分葡萄糖、玉米漿、硫酸銨等的優(yōu)化[9-10]，也有對pH[11]、溶氧等在線條件優(yōu)化[12-13]，這些方法對L-異亮氨酸產(chǎn)量的提高都有很大幫助。

對于谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸的最大難題在于副產(chǎn)物積累過多，導(dǎo)致抑制菌體細胞生長，降低菌體活力、產(chǎn)酸下降。本實驗通過全營養(yǎng)流加工藝[14]，探究底物培養(yǎng)基與流加料最適濃度，使菌體始終處于最適發(fā)酵環(huán)境[16]。實驗分為低濃度全營養(yǎng)流加，低初始營養(yǎng)偶聯(lián)發(fā)酵全營養(yǎng)流加，絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加3個階段，找出L-異亮氨酸產(chǎn)量最高、副產(chǎn)物纈氨酸(valine，Val)，亮氨酸(leucine，Leu)，丙氨酸(alanine，Ala)最低的流加條件；同時利用氮源替換實驗，探究出玉米漿與絲肽粉對發(fā)酵的影響[17]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)YILM1504 (LysL+MetL+AHVr+SGr+Ile-Hxr)，由天津科技大學(xué)代謝工程實驗室保存。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(1)：葡萄糖70 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO42.2 g/L，VB10.2 mg/L，豆餅水解液20 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，玉米漿干粉50 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(2)：葡萄糖70 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO42.2 g/L，VB10.2 mg/L，豆餅水解液20 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，絲肽粉 50 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L 自動控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies；KQ-C 高壓蒸汽發(fā)生器，上海奉賢協(xié)新機電廠；752 分光光度計，上海分析儀器廠；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本 OLYMPUS 會社。

1.4 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)條件：一代試管斜面活化2根，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)18 h。

種子罐培養(yǎng)條件：接種量2支茄形瓶，發(fā)酵體積2 L，培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，通風(fēng)2.0 L/min，罐壓0.05 MPa，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，轉(zhuǎn)速上限930 r/min，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，種子培養(yǎng)12～15 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：接種量600 mL，發(fā)酵體積3 L, 培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速由200 r/min逐步提加到930 r/min；通風(fēng)由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，發(fā)酵時間36～40 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 高濃度底料、低濃度全營養(yǎng)流加方法

A(B、C、D)流加策略為發(fā)酵罐配制100%(1)號培養(yǎng)基2.7 L，從20 h流加300 mL 0%(5%、10%、15%)(1)號培養(yǎng)基濃縮液，濃縮液40 h流加完。

1.5.2 低初始營養(yǎng)偶聯(lián)發(fā)酵全營養(yǎng)流加策略

E(F、G、H)流加策略為發(fā)酵罐配制10%(30%、50%、70%)(1)號培養(yǎng)基2.7 L，從0 h流加300 mL 90%(70%、50%、30%)(1)號培養(yǎng)基濃縮液，濃縮液全程流加，底料與流加料質(zhì)量固定為3 L(1)號培養(yǎng)基。

1.5.3 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加方法

將(1)號培養(yǎng)基中玉米漿等質(zhì)量置換為絲肽粉成為(2)號培養(yǎng)基。

I、J、K流加策略以F流加策略為基準，分別將其中的(1)號培養(yǎng)基等比例置換成30%、70%、100%(2)號培養(yǎng)基。全營養(yǎng)流加策略如表1所示。

1.6 檢測方法

1.6.1 pH值測定

發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH在線檢測，用pH試劑進行放液驗證檢測。

1.6.2 菌體生物量測定

菌體生物量以每升發(fā)酵液中菌體干重(g DCW/L)表示。發(fā)酵液離心后用去離子水洗滌菌體2次，于80 ℃恒溫箱中加熱至恒重后，用分析天平稱重。

表1 全營養(yǎng)流加策略Table 1 Total nutrient flow plus strategy

1.6.3L-異亮氨酸及副產(chǎn)物測定

發(fā)酵液中L-異亮氨酸和副產(chǎn)物濃度用高效液相色譜法測定。采用AgilentC18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱，衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.7 計算方法

糖酸轉(zhuǎn)化率(sugar acid,SA)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ，L-異亮氨酸質(zhì)量濃度，g/L；V，發(fā)酵液總體積，L；m，總耗糖量，g。

所有實驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnet t檢驗來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低濃度全營養(yǎng)流加對發(fā)酵的影響

在氨基酸生產(chǎn)過程中，常采用一次性投料發(fā)酵，但初始發(fā)酵時發(fā)酵液中高濃度營養(yǎng)會造成菌體的營養(yǎng)中毒，抑制菌體的生長，同時導(dǎo)致菌體代謝途徑的異常，使得發(fā)酵罐內(nèi)某些營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，極容易發(fā)生菌體過早衰亡的現(xiàn)象。首先，本實驗為延長生長周期，提升菌體活力，通過發(fā)酵初期低營養(yǎng)，發(fā)酵過程全營養(yǎng)流加工藝，探究發(fā)酵中后期全營養(yǎng)流加對發(fā)酵的影響，實驗設(shè)置A、B、C、D 4種流加策略，以策略A為對照組，進行發(fā)酵對比實驗。

圖1 低濃度全營養(yǎng)流加對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.1 Effect of low concentration total nutrient flow on biomass and L-isoleucine注：實心圖標為菌體生物量、空心圖標為L-異亮氨酸產(chǎn)量(圖4、圖7同)

由圖1可知，流加策略A為全營養(yǎng)培養(yǎng)基底料，不流加培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵至15 h后，菌體活力降低，20 h菌體生物量開始下降，從最高菌體量30.6 g/L降低到23.3 g/L，同時此時產(chǎn)酸能力放緩，L-異亮氨酸產(chǎn)量為29.7 g/L。為解決發(fā)酵中后期菌體生物量下降問題，流加策略B、C、D分別在20 h流加5%、10%、15%的全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃縮液，發(fā)現(xiàn)菌體量停止下降且小幅上升，最終菌體量分別達到了33.3、37.2、34.8 g/L，比對照組最終菌體量提高了42.9%、59.7%、49.4%，L-異亮氨酸分別達到了29.0、33.0、31.5 g/L，比對照組提高了26.1%、43.5%、40.0%。

由圖2可知，隨著流加糖濃度的上升，發(fā)酵葡萄糖消耗量逐漸上升但幅度較小，分別比對照組多消耗了3.3%、4.7%、5.6%；但葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率及L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率顯著上升(P<0.05),在26 h，對照組葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率<0.01 g/g，菌體活力極弱，菌體生長繁殖近乎停滯；隨著對發(fā)酵罐流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃縮液，20 h后葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率明顯上升，26 h轉(zhuǎn)化率達到了0.08、0.1、0.1，菌體仍有活力；同時26 h B、C、D流加策略的葡萄糖對L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率都為0.22 g/g，流加策略效果顯著。

圖2 低濃度全營養(yǎng)流加對葡萄糖消耗及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of low concentration total nutrient flow on glucose consumption and glucose conversion注：實心圖標為葡萄糖消耗量、空心圖標為葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率、半實心半空心為葡萄糖L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率(圖5同)

由圖3可知，流加策略對合成L-異亮氨酸提升效果明顯，同時對副產(chǎn)物的降低也有作用，流加策略B、C、D的Val分別達到了5.0、6.8、6.1 g/L，比對照組降低了37.5%、15.2%、23.8%，Leu分別為3.2、3.8、3.4 g/L，比對照組降低了46.7%、36.7%、43.3%，Ala分別為2.8、3.2、3.1 g/L，比對照組降低了37.8%、28.9%、31.1%。

圖3 低濃度全營養(yǎng)流加對產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effects of low concentration total nutrient flow on acid production

由上述結(jié)果可知，通過發(fā)酵中后期全營養(yǎng)流加策略，提高了葡萄糖的利用率及產(chǎn)酸能力，解決了20 h后菌體迅速衰亡、活力弱的缺點，這是因為流加培養(yǎng)基修正了發(fā)酵中后期某些必需元素缺失的問題，使菌體能夠再次正常生長，延長了菌體發(fā)酵周期，但副產(chǎn)物Val、Leu、Ala相對于后續(xù)分離提取還是過多。3種副產(chǎn)物的積累過多使菌體代謝異常，再次影響了菌體的正常生長，同時出現(xiàn)糖酸轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品質(zhì)量下降、提取困難等一系列問題。

2.2 低初始營養(yǎng)偶聯(lián)發(fā)酵全營養(yǎng)流加策略

為了解決發(fā)酵初期底物營養(yǎng)過豐富而抑制菌體的問題，本實驗通過降低初始發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，采用低濃度初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，在發(fā)酵過程流加全營養(yǎng)，以期降低發(fā)酵初期高營養(yǎng)抑制，并通過流加解決后期營養(yǎng)不足的問題。設(shè)計E、F、G、H流加策略，以A的培養(yǎng)基含量為基準，將培養(yǎng)基按比例分為底料與流加料，發(fā)酵全程流加，探究最適底料與流加料分配比例。

由圖4可知，生物量與L-異亮氨酸隨著底料與流加料質(zhì)量比上升而上升，當(dāng)?shù)琢吓c流加料為3∶7時，產(chǎn)酸與生物量達到最高。發(fā)酵40 h，流加策略E、F、G、H的菌體量分別為43.0、46.0、42.0、40.0 g/L，比對照組最大菌體量提高了40.5%、50.3%、37.3%、30.7%，L-異亮氨酸產(chǎn)量達到了34.8、36.8、34.0、33.6 g/L，比對照組分別提高了17.2%、23.9%、14.5%、13.1%。菌體量與L-異亮氨酸隨著底料與流加料比例增加增長明顯，因此高濃度底料是限制菌體增長的重要因素之一[18]。

圖4 低初始營養(yǎng)偶聯(lián)全營養(yǎng)流加策略對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.4 Effects of total nutrient flow addition strategy on biomass and L-isoleucine in low initial nutrient

菌體對葡萄糖的利用率是評價菌株優(yōu)良性狀及發(fā)酵能力的重要指標之一，同時也是產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)的重要指標之一[19]。由圖5可知，葡萄糖對菌體及L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率隨著底料與流加料比例的增加而增長，其表現(xiàn)為流加策略E、F、G、H的葡萄糖對L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率后期下降平穩(wěn)，26 h轉(zhuǎn)化率分別為0.29、0.30、0.28、0.23 g/g,比對照組提高了93.3%、100%、86.7%、53.3%，且始終保持在0.1 g/g以上；E、F、G、H的葡萄糖對菌體的轉(zhuǎn)化率分別為0.10、0.13、0.10、0.11 g/g，菌體活力旺盛。根據(jù)葡萄糖消耗曲線，E、F、G、H的葡萄糖消耗量分別為349.7、361.2、382.0、383.5 g/g，比對照組提升了3.0%、6.4%、12.5%、13.0%；可以看出葡萄糖消耗的增加量遠小于葡萄糖對菌體及L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化能力的提升，說明不同比例低濃度培養(yǎng)基底料添加與全營養(yǎng)流加有利于糖的正向利用率，減少了菌體細胞內(nèi)其他非需求物質(zhì)的產(chǎn)生，代謝主流導(dǎo)向理想載流途徑[20]。

圖5 低初始營養(yǎng)偶聯(lián)發(fā)酵全營養(yǎng)流加策略對葡萄糖消耗量及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effects of total nutrient flow plus strategy on glucose consumption and glucose conversion in low initial nutrient

圖6-a中，E、F、G、H的Val分別為5.2、5.6、6.2、6.0 g/L，比對照組降低了35.0%、30.0%、22.5%、25.0%；圖6-b中，E、F、G、H的Leu分別為2.2、2.3、2.7、3.0 g，比對照組降低了21.4%、17.9%、3.6%、7.1%；圖6-c中，E、F、G、H的Ala分別為1.7、2.1、2.3、2.1 g/L，比對照組降低了39.3%、25%、17.9%、25%。從副產(chǎn)物曲線趨勢可以看出，Val、Leu與Ile出現(xiàn)時間相近、產(chǎn)酸協(xié)同，且增長趨勢都隨著時間的推移逐漸降低；Ala的直接前體是丙酮酸，而Val、Leu的直接前體也是丙酮酸，隨著發(fā)酵時間的持續(xù)，Val、Leu逐漸降低，而Ala卻隨著時間的推移越來越多。

從以上結(jié)果分析可知，底料、流加料雙梯度全營養(yǎng)流加對生物量及L-異亮氨酸的生成效果顯著，且降低了副產(chǎn)物的生成，解決了高濃度培養(yǎng)基對菌體生長及產(chǎn)酸的抑制作用[21]；但生成的副產(chǎn)物對于產(chǎn)品純化及產(chǎn)品工業(yè)化來說，同樣相對較高，所以需要找到一種方法，在保持對L-異亮氨酸產(chǎn)量影響較小的情況下，將副產(chǎn)物降低到產(chǎn)業(yè)化標準的濃度之下。

2.3 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加對L-異亮氨酸的影響

同時，在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，由于玉米漿使用量過大，造成滅菌困難，容易染菌；玉米漿中蛋白質(zhì)含量高，造成發(fā)酵過程泡沫過多，溶氧不足；玉米漿中灰分高，造成分離提取產(chǎn)物雜質(zhì)高等問題。因此，有必要降低玉米漿的用量，利用清潔的有機氮源替換玉米漿。本實驗利用絲肽粉代替一部分玉米漿。設(shè)計氮源替換實驗，以流加策略F為基準，將發(fā)酵培養(yǎng)基(1)中玉米漿逐步替換為絲肽粉，探究玉米漿與絲肽粉在發(fā)酵中對副產(chǎn)物生成的影響。

由圖7可知，隨著絲肽粉替換玉米漿比例的上升，菌體生物量及產(chǎn)酸能力逐漸降低，發(fā)酵40 h，流加策略I、G、K的生物量為44.2、41.4、40.0 g/L，比對照組提升了89.7%、77.7%、71.7%，卻比基準組F降低了3.9%、10.0%、13.0%；L-異亮氨酸產(chǎn)量為 36.1、34.2、33.1 g/L，比對照組提高了21.5%、15.2%、11.4%，比基準組降低了1.9%、7.1%、10.1%。玉米漿中含有大量的亞硫酸、肽、多糖、蛋白質(zhì)和各種氨基酸，在氨基酸發(fā)酵中被用作有機氮源和生長因子的供應(yīng)者，從結(jié)果可以看出在提高產(chǎn)酸能力、促進菌體生長的功能上玉米漿無法被絲肽粉替代。

圖7 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加對生物量及L-異亮氨酸的影響Fig.7 Effects of total nutrient flow on biomass and L-isoleucine in corn pulp with equal proportion of silk peptide powder

丙酮酸是Val、Leu的直接前體，同時反應(yīng)生產(chǎn)活性乙醛與乙酰輔酶A，活性乙醛參與合成Ile和Val，乙酰輔酶A參與Leu的合成，前體物對Val、Leu的生成有協(xié)同作用；乙酰羥基酸合成酶、二羥基脫水酶、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶等一系列酶共同參與三支鏈氨基酸的合成，反應(yīng)酶對Ile和Val、Leu的生成有協(xié)同作用。由圖8可知，在L-異亮氨酸產(chǎn)量降低的同時，副產(chǎn)物Ile和Val、Leu也大幅降低，這驗證了Ile、Val、Leu生產(chǎn)協(xié)同的結(jié)論。流加策略I、G、K的Val分別為1.4、1.2、1.0 g/L，比對照組降低了82.5%、85%、87.5%；Leu分別為0.8、0.6、0.5 g/L，比對照組降低了75.0%、81.3%、84.4%；Ala分別為0.5、0.3、0.3 g/L，比對照組降低了78.6%、82.1%、82.1%。絲肽粉為優(yōu)質(zhì)清潔氮源，其生物素含量低、灰分≤6%，總氮(以N計)≥30%，同時從葡萄糖對L-異亮氨酸的轉(zhuǎn)化率曲線可以看出，隨著絲肽粉替換玉米漿比例的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸上升。

由上述結(jié)果可以得出，絲肽粉在抑制菌體的生成及L-異亮氨酸的產(chǎn)量上不及玉米漿，但會大幅度降低副產(chǎn)物Val、Leu、Ala的生成，達到工業(yè)生產(chǎn)及產(chǎn)品純化的要求，所以為了既減少對菌體和L-異亮氨酸的抑制，又減少副產(chǎn)物的生成，可以選用流加方法I，即在F的流加基礎(chǔ)上，將30%的玉米漿替換為絲肽粉，對產(chǎn)酸能力影響較小，L-異亮氨酸產(chǎn)量達到36.1 g/L，同時副產(chǎn)物Val、Leu、Ala分別為1.4、0.8、0.5 g/L，達到產(chǎn)業(yè)化標準。

圖8 絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加對產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effects of total nutrient flow on acid production and conversion of corn pulp with equal proportion of silk peptide powder to replace the corn syrup

3 結(jié)論

在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸過程中，L-異亮氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物含量是評價菌株優(yōu)良性狀及發(fā)酵能力的重要指標之一。實驗通過高濃度底料、低濃度全營養(yǎng)流加策略，提升中后期菌體活力，加強產(chǎn)酸能力，其底料為3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，在20 h后流加10%(1)號全營養(yǎng)培養(yǎng)基，最終生物量與L-異亮氨酸分別達到了37.2、33.0 g/L，比對照組提高了57.7%、43.5%。為解決前期高營養(yǎng)對菌體造成營養(yǎng)中毒，實驗通過降低初始發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，采用低濃度初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，在發(fā)酵過程流加全營養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)配制3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，底料一次性添加30%，剩下70%作為濃縮液全程流加，使得生物量與L-異亮氨酸達到了46.0、36.8 g/L，比對照組提高了97.4%、60.0%。為減少由于玉米漿的高用量造成發(fā)酵染菌、起泡過多及后提取困難等問題,同時降低發(fā)酵副產(chǎn)物，提高產(chǎn)品純度，實驗設(shè)計氮源替換實驗，用清潔絲肽粉等比例替換玉米漿全營養(yǎng)流加，最終發(fā)現(xiàn)流加策略I最優(yōu)，即將發(fā)酵培養(yǎng)基中30%的玉米漿替換為絲肽粉，使得副產(chǎn)物Val、Leu、Ala分別為1.4、0.8、0.5 g/L，比對照組降低了82.5%、86.7%和88.9%，同時探究出玉米漿有利于菌體的生長及L-異亮氨酸產(chǎn)量的提高，而絲肽粉有利于發(fā)酵中副產(chǎn)物Val、Leu、Ala的降低。