賀 禎，趙永強(qiáng)，孔凌霄，陳劍秋

順鉑（Cisplatin）的抗癌特性在20 世紀(jì)60 年代被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛用于許多實(shí)體腫瘤，然而順鉑在臨床化療中的不良反應(yīng)如血液系統(tǒng)毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、耳毒性，往往不可避免［1］。順鉑引起的耳毒性可導(dǎo)致雙側(cè)、進(jìn)行性、劑量依賴性的感覺神經(jīng)性聽力損失，聽力損失會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。盡管尚不清楚順鉑引起耳毒性的基本分子機(jī)制，但先前的研究表明，順鉑激活線粒體活性氧生成途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［2］。過量活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的產(chǎn)生被認(rèn)為是順鉑誘導(dǎo)的耳毒性的主要原因，也是順鉑對DNA 的直接攻擊［3］。

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，ALA），是線粒體脫氫酶反應(yīng)中不可或缺的輔助因子，可溶于水和脂質(zhì)，并廣泛分布在細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間。Biewenga 等報(bào)道了ALA 的保護(hù)作用，他們發(fā)現(xiàn)ALA 可以減輕由于維生素C 和E 缺乏引起的壞血病癥狀［4］。后續(xù)的研究證明，ALA 是人體內(nèi)一種效應(yīng)強(qiáng)大的抗氧化劑，并對包括維生素C、E 和還原型谷胱甘肽等抗氧化劑有協(xié)同加成能力［5］。

筆者擬通過建立大鼠順鉑聽力損害動(dòng)物模型，研究ALA 對順鉑誘導(dǎo)的聽力損失的影響，并推測ALA 激活的抗凋亡途徑在體外防止順鉑誘導(dǎo)的耳毒性的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康BALB/c 小鼠40 只，重量18～22 g，耳郭反射正常，雌雄兼用，室溫下常規(guī)飲食安靜飼養(yǎng)。所有涉及動(dòng)物的程序均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)定。

1.2 材料和儀器注射用順鉑 （齊魯制藥廠，國藥準(zhǔn)字H37021356）；注射用硫辛酸 （江蘇奧賽康藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20061176）；TRITC Phalloidin 羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽 （上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)：40734ES75） 小鼠8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine單克隆抗體 （Anti-8-OHdG）（abcam 公司，貨號(hào)ab48508）；GSH-Px 多克隆抗體（abcam 公司，貨號(hào)ab51948）；小鼠Bax 單克隆抗體（abcam 公司，貨號(hào)ab77566）；小鼠Bal-2 單克隆抗體（abcam 公司，貨號(hào)ab154140）。聽覺誘發(fā)電位一耳聲發(fā)射記錄使用美國Smart EP&OAE 智聽公司系統(tǒng)。共聚焦顯微鏡使用德國Zeiss，LSM 700。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與設(shè)計(jì)使用前瞻性隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物小鼠分為以下四組：對照組、順鉑組、硫辛酸+順鉑組、硫辛酸組（每組10只小鼠，20 耳）。順鉑組小鼠給予腹腔注射順鉑4 mg/kg·d，連續(xù)5 d；硫辛酸組小鼠給予腹腔注射硫辛酸20 mg/kg·d，連續(xù)6 d；順鉑+硫辛酸組小鼠提前1 d預(yù)處理，腹腔注射硫辛酸20 mg/kg·d，在第2 天同時(shí)腹腔注射順鉑4 mg/kg·d，連續(xù)5 d；對照組僅給予腹腔注射等量生理鹽水。四組停藥后復(fù)查聽性腦干反應(yīng) （auditory brainstem response，ABR），完成ABR 檢查后處死小鼠取耳蝸用于形態(tài)學(xué)觀察及后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 聽性腦干反應(yīng)的檢查為了評估聽覺功能，筆者對小鼠在給藥前后進(jìn)行了ABR 檢查。所有測試均在隔音室內(nèi)進(jìn)行。在進(jìn)行ABR 檢查之前，參照文獻(xiàn)方法［6］通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉動(dòng)物，將皮下針電極插入到顱頂正中皮下（+電極），乳突（-電極）和后腿（接地）中。通過揚(yáng)聲器單聲道施短純聲音刺激，頻率分別為8、16 和32。從90 dB 聲壓級(jí)開始，以5 dB 的減量重復(fù)的刺激。

1.5 組織學(xué)切片和形態(tài)學(xué)分析四組動(dòng)物停藥并完成ABR 檢查后，立即斷頭處死，參照文獻(xiàn)方法速取聽泡［6，7］。充分暴露耳蝸后，顯微鏡下刺破圓窗和卵圓窗，蝸尖鉆孔并使用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 溶液緩慢灌注小鼠內(nèi)耳，將耳蝸標(biāo)本用含0.10%戊二醛＋4%多聚甲醛混合液的雙固定液固定24 h，立體顯微鏡下去除骨性蝸管等結(jié)構(gòu)，分離出基底膜。此步完成之后，分別制作掃描電鏡標(biāo)本、免疫熒光標(biāo)本及石蠟切片。（1）掃描電鏡標(biāo)本置于3%戊二醛中送山東大學(xué)電鏡中心，由電鏡中心進(jìn)行掃描電鏡所需的各項(xiàng)處理，同電鏡中心工作人員一起觀察標(biāo)本并照相。（2）免疫熒光標(biāo)本在4% EDTA 脫鈣24 h 后，用虹膜刀小心分離基底膜，PBS 沖洗后標(biāo)本在室溫下與0.1%Triton X-100 孵育15 min，1∶40的TRITC-鬼筆環(huán)肽染色2 h，然后用PBS 洗滌3次。使用共聚焦顯微鏡鏡下觀察。（3）石蠟切片，耳蝸用梯度乙醇系列脫水，用二甲苯滲透，并在室溫下包埋在石蠟中。然后使用切片機(jī)將石蠟包埋的內(nèi)耳連續(xù)切成6 μm 厚的切片，以備下一步免疫組化分析用。

1.6 免疫組化分析8-OHdG 表達(dá)石蠟切片脫蠟和干燥后，微波修復(fù)，滴加1 滴3%H2O2，室溫下孵育10 min，用PBS 洗滌5～10 min 后，將標(biāo)本與小鼠8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）單克隆抗體室溫下放置2 h，用PBS 洗滌兩次，每張切片加1 滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min。PBS 沖洗后加1 滴酶標(biāo)聚合物，室溫下孵育30 min。PBS 沖洗后將3-3'二氨基聯(lián)苯胺（DAB）色原滴到切片上，并原位放置5～10 min 以吸收色原。通過將樣本在蘇木精中保留1～2 min 來提供背景染色。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析ABR 檢查后斷頭處死，取出耳蝸組織，每2 個(gè)耳蝸合為一份標(biāo)本，放入RIPA裂解液，低溫震蕩研磨，低溫高速離心30 min。取上清液并測定蛋白含量。灌膠后上樣，SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，室溫孵育1 h 后，加入1∶1000 稀釋的GSH-Px、Bax、Bal-2 一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 沖洗后加入二抗（1∶1000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 沖洗，顯影，Image J 圖像分析軟件對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示。正組間兩兩多重比較使用t 檢驗(yàn)，同時(shí)，對組織病理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行Ridit 分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR 閾值偏移使用小鼠模型檢查了ALA對順鉑誘導(dǎo)的耳毒性的保護(hù)作用。小鼠于給藥處理前后經(jīng)麻醉后測試ABR 數(shù)值，將前后2組數(shù)值相減，得出差值，即為ABR 閾值偏移以客觀評價(jià)小鼠耳蝸的聽力受損情況。對于對照組和ALA組，ABR的閾值偏移均＜5 dB，這表明正常小鼠的ALA 治療不會(huì)影響聽力。順鉑組的ABR 閾值偏移較對照組顯著上升，證實(shí)了順鉑治療會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的聽力損失。硫辛酸+順鉑組閾值偏移明顯小于順鉑組，表明用ALA 進(jìn)行的處理干預(yù)可以明顯保護(hù)聽力。見圖1。

圖1 見封三。

圖1 4組小鼠干預(yù)前后ABR 閾值偏移

2.2 形態(tài)學(xué)觀察使用共聚焦顯微鏡觀察鬼筆環(huán)肽染色后的基底膜以及電鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變，均發(fā)現(xiàn)順鉑組耳蝸外毛細(xì)胞數(shù)量減少、形態(tài)改變，硫辛酸+順鉑組使用ALA 干預(yù)后較順鉑組耳蝸外毛細(xì)胞數(shù)量增加、形態(tài)恢復(fù)。具體表現(xiàn)為：順鉑組共聚焦顯微鏡下外毛細(xì)胞數(shù)量減少、明顯變性，硫辛酸+順鉑組外毛細(xì)胞數(shù)量明顯較順鉑組增加，細(xì)胞變性減輕；電鏡下，順鉑組耳蝸外毛細(xì)胞數(shù)目減少，形態(tài)上靜纖毛見明顯缺失、倒伏和融合，排列散亂，硫辛酸+順鉑組外毛細(xì)胞數(shù)量較順鉑組明顯恢復(fù)，外毛細(xì)胞靜纖毛僅見個(gè)別自然缺失、融合。形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)順鉑對外毛細(xì)胞有明顯損害，使用ALA 后這種損害得到了明顯的保護(hù)和減輕。見圖2。

2.3 免疫組化觀察DNA 損傷為了從免疫組織化學(xué)的角度鑒定氧化性DNA 損傷，進(jìn)行了8-OHdG染色。對照組或硫辛酸組均未觀察到8-OHdG 免疫陽性（圖3A、B）。在順鉑組的外毛細(xì)胞中確定了嚴(yán)重的免疫陽性（圖3C）。在硫辛酸+順鉑組中，在外毛細(xì)胞中觀察到了少量的8-OHdG 表達(dá) （圖3D）。硫辛酸+順鉑組較順鉑組之間的8-OHdG 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖3 見封三。

2.4 Western blot 檢測通過Western blot 檢測了GSH-Px 和Bax/Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平。在用ALA 治療的2組中，GSH-Px 表達(dá)均較對照組明顯上調(diào)（圖4A）；順鉑處理比對照組更多地上調(diào)了Bax表達(dá)，ALA 處理的細(xì)胞顯著下調(diào)了Bax 表達(dá) （圖4B）；順鉑處理下調(diào)了Bcl-2 的表達(dá)，ALA 處理的細(xì)胞恢復(fù)了Bcl-2 的表達(dá)（圖4B）。

圖2 小鼠模型的形態(tài)學(xué)變化

圖3 8-OHdG染色從免疫組化觀察DNA 損傷

圖4 western blot 分析GSH-Px 和Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)

3 討論

順鉑誘導(dǎo)的耳毒性臨床表現(xiàn)為雙側(cè)對稱性、進(jìn)行性、劑量依賴性的感音神經(jīng)性聽力損失［8］。筆者在該項(xiàng)研究中使用了ABR 測試來顯示在耳蝸中產(chǎn)生的功能損傷。該測試在第1 天和第6 天對所有大鼠進(jìn)行了兩次測試。在所有頻率下，順鉑組小鼠的ABR 閾值均明顯高于其他三組。這表明順鉑具有耳毒性作用，可在所有研究頻率下引起聽力損失。

由于耳毒性是限制順鉑在臨床使用的不良反應(yīng)之一，因此有研究報(bào)道了多種藥物的潛在耳保護(hù)作用。理想的耳保護(hù)劑必須提供可靠的保護(hù)，同時(shí)又不損害順鉑的抗腫瘤作用。在這種情況下，引起最大關(guān)注的試劑是消除ROS 的抗氧化劑。α-硫辛酸（ALA） 是一種衍生自辛酸的有機(jī)硫酸鹽化合物，被認(rèn)為是最有效的細(xì)胞抗氧化劑之一。ALA 可以還原為二氫硫辛酸，是活性氧（ROS）的強(qiáng)抗氧化劑［9，10］。因其強(qiáng)大的抗氧化性能，筆者調(diào)查了α-硫辛酸（ALA）的耳保護(hù)作用。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALA 本身對耳蝸細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面作用即無耳毒性。

順鉑誘導(dǎo)的耳毒性作用表現(xiàn)之一為外毛細(xì)胞受損。內(nèi)耳中對順鉑最敏感的結(jié)構(gòu)是毛細(xì)胞。耳蝸基部轉(zhuǎn)彎中的外毛細(xì)胞是受影響最大的細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)ROS 的過度積累已被認(rèn)為是順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最強(qiáng)觸發(fā)因素［11］。在外源性順鉑刺激下，ROS快速釋放并在耳蝸毛細(xì)胞過度蓄積，氧化應(yīng)激程度超出耳蝸毛細(xì)胞抗氧化能力，進(jìn)而造成毛細(xì)胞DNA 的氧化損傷。DNA 損傷后能夠產(chǎn)生大量嘌呤羥基化、嘧啶羥基化的堿基修飾產(chǎn)物，在目前的各種堿基修飾產(chǎn)物，8-羥基脫氧鳥苷 （8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG） 是一種公認(rèn)的能夠反映DNA 氧化損傷的標(biāo)志物［12，13］。筆者對8-OHdG 免疫組化的結(jié)果表明，在順鉑組小鼠的外毛細(xì)胞中有明顯的8-OHdG 免疫陽性，而硫辛酸+順鉑組少量表達(dá)8-OHdG。

在細(xì)胞抗氧化劑系統(tǒng)中，谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px） 催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫等氧化陰離子發(fā)生還原反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 減少，即GSH 被GSH-Px 氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），阻斷ROS 細(xì)胞類脂過氧化［14，15］。有報(bào)道顯示，ALA 參與了谷胱甘肽的氧化和還原，通過幫助將GSSG 還原為GSH，維持了細(xì)胞內(nèi)GSH 的水平，使其可用作GSH-Px 的底物，將過氧化氫還原為水［16］。在該項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)ALA治療干預(yù)后的小鼠耳蝸內(nèi)GSH-Px 表達(dá)被ALA 高度上調(diào)。而且既往的研究表明，GSH-Px 影響抗凋亡Bcl-2 的表達(dá)及其活性，所以在保護(hù)小鼠耳蝸細(xì)胞免受ROS 誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡中起著重要作用。GSH-Px 過表達(dá)通過增加Bcl-2 表達(dá)并降低Bax 表達(dá)來有效抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［17，18］。該研究同樣也發(fā)現(xiàn)使用ALA 后，較順鉑組小鼠，硫辛酸+順鉑組出現(xiàn)Bcl-2 表達(dá)上調(diào)、Bax 表達(dá)下調(diào)。因此，ALA 通過有效上調(diào)GSH-Px，繼而影響B(tài)cl-2/Bax 凋亡信號(hào)通路。Bcl-2/Bax 信號(hào)通路中，Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡，Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

該研究結(jié)果顯示，ALA 對順鉑誘導(dǎo)的耳毒性具有較強(qiáng)的緩解作用，從而最終防止了硫辛酸+順鉑組小鼠的重大聽力損失。筆者采用8-OHdG 染色從免疫組化的角度揭示氧化性DNA 損傷是順鉑導(dǎo)致耳毒性的機(jī)制之一，并且發(fā)現(xiàn)ALA 通過支持GSHPx 活性來恢復(fù)氧化還原系統(tǒng)對抗氧化應(yīng)激損傷。