劉冬，李萍，高智謀

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，安徽 合肥230036)

疫霉菌的菌絲生長速率在無性后代通?？梢苑€(wěn)定遺傳，在有性后代基本上都會發(fā)生明顯變異。然而，生長速率在部分疫霉菌的無性后代會發(fā)生變異[1]；部分苧麻疫霉菌株生長速率在有性后代可穩(wěn)定遺傳，認為控制生長速率的遺傳因子是純合的[2]。一般而言，疫霉菌的菌落形態(tài)在無性后代可以穩(wěn)定遺傳，在有性后代發(fā)生復(fù)雜變異，如寄生疫霉、掘氏疫霉、苧麻疫霉、惡疫霉和樟疫霉等的菌落形態(tài)在單游動孢子后代均可以穩(wěn)定遺傳[1-4]。但也有例外，研究人員發(fā)現(xiàn)大雄疫霉中某些菌株菌落形態(tài)在單游動孢子后代發(fā)生很大變異[5]；苧麻疫霉的部分菌株菌落形態(tài)在單游動孢子后代出現(xiàn)親本型(P型)和變異型(S型)，S型菌株菌落形態(tài)在單游動孢子后代繼續(xù)分離為P型和S型[6]。疫霉菌的交配型存在十分復(fù)雜的遺傳與變異現(xiàn)象，不同的研究人員對于疫霉菌交配型的遺傳機理和背景的觀點不全一致，較為一致的意見認為是由細胞核遺傳因子控制交配型的。關(guān)于辣椒疫霉不同致病力菌株生物學(xué)性狀的遺傳與變異研究鮮有報道，辣椒疫霉菌落形態(tài)在無性后代穩(wěn)定遺傳，辣椒疫霉種內(nèi)交配產(chǎn)生的卵孢子后代出現(xiàn)了明顯不同于親本類型的菌落形態(tài)[7-8]。本文對不同致病力的辣椒疫霉的生長速率、菌落形態(tài)和異宗配合性狀在單游動孢子后代和自交單卵孢后代進行了遺傳與變異研究，旨在揭示各個生物學(xué)性狀的遺傳特征、遺傳多樣性及遺傳變異特點。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試辣椒疫霉P. capsici菌株HF4(A2型，強致病力)、HN3(A1型，弱致病力)、HX2(A2型，弱致病力)和FY2(A1型，強致病力)分別采集于安徽省合肥市、淮南市、巢湖市和阜陽市。標準交配型菌株A1交配型(P991)和A2交配型(P731)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授惠贈。

1.2 供試培養(yǎng)基

10%的V8培養(yǎng)液和胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)配制參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》進行，分別用于誘導(dǎo)游動孢子囊和卵孢子的產(chǎn)生，以及辣椒疫霉的培養(yǎng)和挑選的單孢株培養(yǎng)，建立單游動孢子無性系。水瓊脂培養(yǎng)基(WA)和S+L培養(yǎng)基分別用于辣椒疫霉單孢分離和卵孢子的萌發(fā)，參考戚仁德等人的報道的方法配制。

1.3 單游動孢子無性系的建立

1.3.1 誘導(dǎo)孢子囊的產(chǎn)生及游動孢子釋放 參照Wu等人的方法[9]，誘導(dǎo)孢子囊的產(chǎn)生及游動孢子釋放。CA上培養(yǎng)的辣椒疫霉取菌碟6～8塊，在10%V8培養(yǎng)液中25 ℃黑暗培養(yǎng)72 h后，無菌水誘導(dǎo)產(chǎn)生大量孢子囊。低溫5℃處理10～15 min，置于室溫下30 min，可見游動孢子。

1.3.2 單游動孢子的分離及單孢系的建立 單游動孢子的分離及單孢系的建立參考戚仁德等人報道的方法[7,10]，在水瓊脂培養(yǎng)基平板上加入游動孢子懸浮液約150 uL涂布均勻，25 ℃下黑暗培養(yǎng)12 h產(chǎn)生芽管。用10×10倍顯微鏡鏡檢，將僅有一個萌發(fā)的游動孢子及其芽管連同周圍的培養(yǎng)基移至CA培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d形成單游動孢子菌落，即為單游動孢子株。以各菌株的單游動孢子株為親本，分別建立第一代游動孢子株系ZG1；從ZG1群體中隨機挑選一個單孢株，以其為親本建立第二代ZG2；再從ZG2群體中隨機挑選一個單孢株，以其為親本建立第三代ZG3。

1.4 單卵孢株群體的建立

1.4.1 卵孢子產(chǎn)生的誘導(dǎo)及萌發(fā) 采用聚碳膜間隔配對法[11]誘導(dǎo)產(chǎn)生卵孢子，將供試菌株和對應(yīng)交配型的辣椒疫霉菌株同時在V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d(黑暗25℃)，將菌落切成小塊，取供試菌株的菌絲塊于空培養(yǎng)皿，菌絲面朝上，覆蓋滅菌的聚碳膜，再將對應(yīng)交配型菌株的菌絲塊置于聚碳膜上方，菌絲面朝下，其位置正好在聚碳膜下方的菌絲塊上。輕壓使上下菌絲塊與聚碳膜緊貼，20～24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)60～90 d。

1.4.2 誘導(dǎo)卵孢子的萌發(fā)及單卵孢株群體的建立 參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》制備卵孢子懸浮液，在S+L培養(yǎng)基(含有五氯硝基苯、多菌靈、青霉素、利福平各50 μg/mL)平板上加卵孢子懸浮液200 μL，涂布均勻。置于25 ℃在16 h日光燈8 h黑光燈交替條件下照射3～14 d。單卵孢株群體的建立與單孢系的建立操作相似，按照“1.3.2”操作完成。

1.5 生長速率、菌落形態(tài)及異宗配合性狀的測定

參考《疫霉菌及其研究技術(shù)》 在CA平板上培養(yǎng)單孢株，記錄菌落直徑和菌落形態(tài)，每個菌株重復(fù)3次，并以各自親本菌株作為對照。交配型的測定采用直接配對法進行，將供試單孢菌株及標準菌株P(guān) 991和P 731于CA培養(yǎng)基上生長5 d，分別取菌落邊緣放入10%的V8平板上(間隔4 cm)。黑暗25 ℃培養(yǎng)10～15 d后，置于10×10倍顯微鏡下檢查兩菌落交界處及其周圍是否有藏卵器、雄器和卵孢子。各供試單孢分別與標準菌株配對，并與自身相配對作為對照，各3次重復(fù)。確定交配型。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)性狀在單游動孢子后代的遺傳與變異

2.1.1 生長速率在單游動孢子后代的遺傳與變異 對辣椒疫霉的單游動孢子后代的生長速率進行測定，供試菌株的單游動孢子后代(ZG1、ZG2和ZG3)的生長速率均與各自親本相似(表1和圖1)。菌株HN3單游動孢子后代的生長速率分布在6.96～8.17 mm/d(親本生長速率為7.71 mm/d；表1)，平均值為7.53、7.65、7.61 mm/d，變異系數(shù)分別為3.76%、3.78%和3.88%。

表1 辣椒疫霉菌株游動孢子后代的生長速率

菌株HF4單游動孢子后代的生長速率在7.04～8.08 mm/d范圍內(nèi)，平均值為7.57、7.52、7.47 mm/d，變異系數(shù)分別為3.10%、3.61%和3.36%。菌株FY2單游動孢子后代的生長速率平均值為6.71、6.80、6.76 mm/d，變異系數(shù)分別為2.91%、2.61%和2.87%。菌株HX2單游動孢子后代的生長速率平均值為7.67、7.63、7.53 mm/d，變異系數(shù)分別為4.04%、3.51%和3.56%。由頻次分布圖1可知，菌株FY2的無性后代群體88%以上菌株的生長速率為6.00～7.00 mm/d；菌株HX2的無性后代群體中，86%以上菌株的生長速率為7.00～8.00 mm/d。單游動孢子后代菌株間及其親本生長速率無顯差異，辣椒疫霉生長速率在單游動孢子后代連續(xù)三代可穩(wěn)定遺傳。

2.1.2 菌落形態(tài)在單游動孢子后代的遺傳與變異 辣椒疫霉單游動孢子后代(ZG1、ZG2和ZG3各50株)的菌落形態(tài)與親本相同。單孢后代在CA平板上生長2 d后，菌落呈圓形，邊緣較整齊、光滑，質(zhì)地均勻，氣生菌絲稀疏、白色絮狀(圖2)。即菌落形態(tài)在單游動孢子后代可穩(wěn)定遺傳。

2.1.3 交配型在單游動孢子后代的遺傳 以不同交配型菌株的單游動孢子株為親本，分別建立單游動孢子ZG1、ZG2和ZG3群體，測定每菌株各單孢后代中各50個單孢株的交配型。結(jié)果表明菌株FY2和HN3與其連續(xù)3代的單游動孢子的交配型相同，均為A1交配型，未發(fā)現(xiàn)其它交配型。菌株HF4和HX2與其連續(xù)3代的單游動孢子后代的交配型相同，均為A2交配型，未發(fā)現(xiàn)其它交配型。結(jié)果顯示辣椒疫霉親本的異宗配合性狀在其游動孢子無性后代中的遺傳非常穩(wěn)定，排除了親本為異核體的可能性[12]。

2.2 生物學(xué)性狀在自交后代的遺傳與變異

2.2.1 生長速率在自交后代的遺傳與變異 辣椒疫霉菌株HN3、HF4、FY2和HX2的自交卵孢子第一代的生長速率進行測定結(jié)果表明各菌株單卵孢后代的生長速率發(fā)生了明顯的變異(表2，圖3)。上述四個單卵孢株群體內(nèi)菌株間及其與親本間的生長速率差異顯著。其中，菌株HN3單卵孢后代群體(30株)的生長速率為1.42～7.50 mm/d，LSD測驗30個單卵孢株中有3株生長速率與親本相似，其余菌株比親本明顯減慢，變異系數(shù)為27.85%，遠高于HN3單游動孢子后代的變異系數(shù)。菌株HF4單卵孢后代群體(30株)的生長速率為2.42～7.79 mm/d，其變異系數(shù)為27.98%，高于HF4單游動孢子后代的變異系數(shù)。菌株FY2單卵孢后代群體(65株)的生長速率為1.91～7.39 mm/d，LSD測驗變異系數(shù)為21.97%，高于FY2單游動孢子后代的變異系數(shù)；菌株HX2單卵孢后代群體(66株)的生長速率為2.11～7.89 mm/d，66個單卵孢株中有2株生長速率與親本相似，變異系數(shù)為21.73%，高于HX2單游動孢子后代的變異系數(shù)。結(jié)果表明辣椒疫霉菌株生長速率性狀在自交后代的變異明顯大于其單游動孢子后代。

表2 辣椒疫霉菌株自交卵孢子后代的生長速率

2.2.2 菌落形態(tài)在自交后代的遺傳與變異 各菌株單卵孢株菌落形態(tài)在自交后代的遺傳結(jié)果如圖4和5所示，菌株HX2在自交S1代單卵孢株群體中除了親本型(P型)外，還出現(xiàn)5種菌落形態(tài)分別為。(1)菌落圓形至近圓形，邊緣整齊但粗糙，菌絲分布均勻但稀疏(HX2S1-54)；(2)菌落形態(tài)不穩(wěn)定，易變異，邊緣不整齊(HX2S1-51)；(3)菌落圓形，邊緣整齊光滑，菌絲致密呈放射狀，無氣生菌絲，生長極其緩慢(HX2S1-36)；(4)菌落圓形或近圓形，邊緣較粗糙，質(zhì)地均勻，表面尤其是中部有氣生菌絲(HX2S1-12)；(5)邊緣光滑不整齊，氣生菌絲呈花點狀(HX2S1-51)。菌株FY2在自交S1代單卵孢株群體中除了出現(xiàn)親本型外，還出現(xiàn)其他不同類型的菌落形態(tài)(圖6-5)，表明菌落形態(tài)在單卵孢株后代發(fā)生變異。同樣地，菌株HN3和HF4單卵孢株后代的菌落形態(tài)除了與親本一致外，部分后代發(fā)生了變異。

2.2.3 交配型在自交后代的遺傳與變異 分別測定了在4個來自于不同地區(qū)的辣椒疫霉異宗配合性狀在自交S1代的遺傳穩(wěn)定性(表3)。菌株HN3、HF4和FY2的自交S1后代中出現(xiàn)了A1和A2兩種交配型，未出現(xiàn)自育型的A1A2交配型，各菌株單卵孢后代A1交配型的比例分別為36.7%、30%和39.1%；A2型菌株HX2的S1代中出現(xiàn)了A1、A2和A1,A2三種交配型，未出現(xiàn)自育型的A1A2交配型，其中A1,A2交配型的比例為4.8%，A1和A2交配型的比例分別為32.3%和62.9%。上述結(jié)果表明，辣椒疫霉A1、A2交配型性狀在自交S1代中不能夠穩(wěn)定遺傳。

表3 辣椒疫霉交配型在自交后代中的遺傳

3 小結(jié)

本文中辣椒疫霉的交配型在無性繁殖后代中能穩(wěn)定遺傳，在有自交后代群體中發(fā)生變異，且自交S1代中不同交配型的分離比例無規(guī)律可循，不符合孟德爾遺傳分離的規(guī)律，因此，本研究認為辣椒疫霉的交配型是由細胞質(zhì)基因控制的，但關(guān)于交配型的遺傳與變異還需進一步探討其機制。