李夢雨，馬瑩，柴新義，張汆，張微微

(滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州，239000)

小麥麩皮是面粉加工中的主要副產(chǎn)物，含有多種人體生長發(fā)育必需的成分，對皮膚、脾肺、腸、胃等均有益處，具有很高的醫(yī)療保健價(jià)值。但其口感粗糙，主要用作動(dòng)物飼料、食用菌培養(yǎng)基質(zhì)及高纖維食品等，開發(fā)利用率較低。近年來，隨著可持續(xù)資源充分利用和能源開發(fā)廣受關(guān)注，麩皮及其提取物的相關(guān)研究逐漸成為熱點(diǎn)[1]。王苗苗[2]等發(fā)現(xiàn)，黑小麥麩皮中所提取到的多酚、黃酮和色素類物質(zhì)含量豐富且具有較好的抗氧化活性。麩皮理化特性和生理功能受條件的影響，水溶性麩皮多酚主要以結(jié)合型阿魏酸的形式存在，其含量可以通過微生物發(fā)酵提高，以增強(qiáng)抗氧化活性[3-4]。

阿魏酸(Ferulic Acid)化學(xué)名稱是4 -羥基-3 -甲氧基肉桂酸，是麩皮中含量最高的酚酸[5]。阿魏酸對包括肺炎桿菌、綠膿桿菌等在內(nèi)的多種致病菌及導(dǎo)致食物變質(zhì)的細(xì)菌具有抑制作用，對機(jī)體卻幾乎沒有毒副作用，可被機(jī)體吸收從尿中排出[6-7]。近年來阿魏酸的抑菌性不斷被證實(shí)且豐富。趙利利[8]等發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對大腸桿菌和蠟狀芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑菌活性并能降低其組胺的產(chǎn)量。薛林林[9]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠顯著抑制屎腸球菌和糞腸球菌的生長以及降低其酪胺的產(chǎn)量。因此，阿魏酸具有成為新型抑菌劑的基礎(chǔ)，有望解決抗生素耐藥等問題[10]，但目前關(guān)于麩皮阿魏酸提取物的抑菌以及阿魏酸抑菌機(jī)理的研究卻較少。

由此，本實(shí)驗(yàn)以麩皮阿魏酸為對象，開展其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌活性及機(jī)理研究，以期為麩皮阿魏酸作為天然安全的抑菌劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，(從微生物工業(yè)菌種中心購買，由本實(shí)驗(yàn)室保存)；麩皮阿魏酸提取物，本實(shí)驗(yàn)室自制，濃度為34 μg/ml；考馬斯亮藍(lán)G-250(北京索萊寶科技有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.2 儀器 T-6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；LS-75HG高壓蒸汽滅菌鍋(濱江醫(yī)療)；HT-400B電熱恒溫水浴箱(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；L550離心機(jī)(湖南湘儀集團(tuán))；DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的培養(yǎng) 從菌管中挑取一環(huán)菌種接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h，稀釋至105cfu/mL，備用。

1.2.2 抑菌活性的測定 濾紙片法測定抑菌圈大小判斷阿魏酸的抑菌活性[11]。用移液槍將20 μL的麩皮阿魏酸提取物打到6 mm濾紙片上，于超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。吸取0.1 mL已經(jīng)稀釋的菌液接種于固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基并涂布均勻，再將風(fēng)干的帶有提取液的濾紙片均勻放置在平板內(nèi)，靜置5 min。將平板在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，測定抑菌圈直徑大小。最小抑菌濃度(MIC)測定，參照糾敏的方法[12]，采用常量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度。取菌懸液依次進(jìn)行梯度稀釋，使得阿魏酸最終濃度分別為：100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。所有處理組置于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)18～24 h，以肉眼不見細(xì)菌明顯生長時(shí)阿魏酸的最低濃度為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 對指示菌株生長曲線的影響 參照曹少謙的方法并稍作修改，將不同濃度的阿魏酸(0MIC、1MIC、3MIC)加入菌懸液中震蕩培養(yǎng)(37 ℃，150 r/min)，培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定OD 值[13]。平行測定3 次，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.4 作用前后對胞外蛋白的影響 將菌液處理為阿魏酸含量分別為0MIC、1MIC、3MIC并置于37 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)。于0、3、9、12 h定點(diǎn)采樣。取1 mL待測樣，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)顯色劑，靜置10 min，于595 nm測定吸光值[14]。

1.2.5 阿魏酸對細(xì)胞壁完整性的影響 使用試劑盒檢測AKP活性以測定細(xì)胞壁完整性。將最終濃度阿魏酸含量為0MIC、1MIC、3MIC的菌懸液置于37 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)。在0 h和12 h取樣，3000 r/min離心10 min，取上清液，用AKP試劑盒測定上清液中堿性磷酸酶含量實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿魏酸提取物對指示菌株抑菌效果

阿魏酸對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖1、2、3，抑菌圈直徑如表1所示。阿魏酸對三種受試細(xì)菌均具有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌作用最明顯。其對受試菌的抑菌活性大小為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，與阿來·海拉西等人的研究結(jié)果一致[16]。阿魏酸對金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，與已證實(shí)的多酚類化合物對革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抑制作用結(jié)果一致[17]。推斷阿魏酸可能有破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖或磷壁酸，使其通透性增加的作用。

表1 阿魏酸提取物作用三種指示菌株的抑菌圈直徑大小

2.2 阿魏酸對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC值

鑒于金黃色葡萄球菌明顯的抑制效果，選取該受試菌株進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。從表2中，可以清晰看到當(dāng)12.5 μg/mL≤阿魏酸質(zhì)量濃度<25 μg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌菌懸液中菌落生長明顯減少，阿魏酸質(zhì)量濃度≥50 μg/mL時(shí)，無細(xì)菌生長。因此阿魏酸對金黃色葡萄球菌的MIC為25 μg/mL。

表2 阿魏酸對金黃色葡萄球菌的MIC

2.3 阿魏酸對金黃色葡萄球菌生長性能的影響

生長曲線法測出的抑菌曲線如圖4所示，直觀地揭示了細(xì)菌群體的生長規(guī)律與阿魏酸濃度變化的情況。不含阿魏酸的金黃色葡萄球菌對照組接種到培養(yǎng)基后的0 ～6 h，細(xì)菌數(shù)量增長較少，為它的適應(yīng)期，6 ～12 h是其生長的對數(shù)期，20 ～24 h為平穩(wěn)期。阿魏酸濃度為3MIC時(shí)，0 ～ h為金黃色葡萄球菌生長的適應(yīng)期，之后進(jìn)入對數(shù)期，其增速相較對照組來說較遲緩。阿魏酸濃度為MIC時(shí)，0 ～ 20 h為其適應(yīng)期，之后開始增長進(jìn)入對數(shù)期，但相比于不加阿魏酸的對照組和含有3MIC阿魏酸的菌液，其增長速度更加低緩。阿魏酸含量為MIC時(shí)，對適應(yīng)期的作用時(shí)間較3MIC濃度略長，但都明顯延長了金黃色葡萄球菌生長的適應(yīng)期。阿魏酸作用于金黃色葡萄球菌，延長了其生長的適應(yīng)期，使其生長減慢。

2.4 阿魏酸對金黃色葡萄球菌胞外蛋白的影響

圖5顯示，胞外蛋白含量在0 ～3 h之間變化不大，在3 ～9 h處于升高的狀態(tài)，9 h后開始降低，含有阿魏酸的實(shí)驗(yàn)組胞外蛋白的含量在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均低于對照組?？扇苄缘鞍资羌?xì)菌重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞生命物質(zhì)及細(xì)胞膜起到保護(hù)作用[18]。胞外蛋白含量實(shí)驗(yàn)組相較于對照組有明顯降低的結(jié)果，說明阿魏酸的作用影響了蛋白質(zhì)的合成和分泌。目前少有關(guān)于多酚類物質(zhì)對抑制蛋白質(zhì)生成機(jī)制的研究，但賈旭東[19]等發(fā)現(xiàn)茶多酚可以抑制人干細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。因此推斷實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可能與阿魏酸破壞了細(xì)胞中核酸，干擾了蛋白質(zhì)的正常翻譯等有關(guān)。

2.5 阿魏酸對細(xì)胞壁完整性的影響

堿性磷酸酶(AKP)是存在于細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間的一種酶，正常情況下，在胞外不能檢測到其活性[20]，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞的通透性增加時(shí)，AKP就會(huì)大量泄漏到胞外。從表3可以看出，胞外AKP酶含量在培養(yǎng)12 h后增加，含有阿魏酸的菌液含量變化幅度最大，對照組的變化最不明顯。在加入阿魏酸后，菌懸液中的AKP含量明顯增加，說明細(xì)胞的壁膜完整性遭到破壞。由此可以推斷阿魏酸抑菌的原因之一是破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁通透性。

表3 阿魏酸對作用后胞外AKP的影響

3 結(jié)論

過濾定容后的阿魏酸提取物濃度為34 μg/mL，這一濃度下的阿魏酸提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其作用效果為金黃色葡萄球菌(12 mm)>枯草芽孢桿菌(9 mm)>大腸桿菌(7.5 mm)。相比于革蘭氏陰性菌，阿魏酸提取物對革蘭氏陽性菌的抑制作用更為明顯。阿魏酸對金黃色葡萄球菌的MIC為25 μg/mL。加入阿魏酸的處理組細(xì)菌生長的適應(yīng)期增長、胞外蛋白含量減少、AKP含量增加，且在MIC條件下變化最為明顯。所以其抑菌機(jī)制與一定濃度下阿魏酸對細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常合成和細(xì)胞壁的干擾和破壞的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其通透性增加有關(guān)。