范衛(wèi)平

(北京虹木生物技術(shù)有限公司，北京 101105)

前言

那屈肝素鈣系從豬小腸黏膜中提取的肝素經(jīng)亞硝酸裂解后，精制而得的硫酸氨基葡聚糖的鈣鹽，是低分子量肝素的一種[1]。那屈肝素鈣臨床用于預(yù)防術(shù)后血栓栓塞、肺栓塞、深靜脈血栓形成、末梢血管病變等，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治療藥物之一[2]。那屈肝素鈣在生產(chǎn)和長期儲存過程中，其糖鏈上的磺酸基團易解離為游離硫酸根，且在獲取肝素原料及生產(chǎn)過程中(如加入氯化鈣進行鈉鈣置換)還會引入其他陰離子如氯離子等，為了確保那屈肝素鈣藥物的純度和穩(wěn)定性，對這些離子的監(jiān)測是非常必要的[3]。

離子色譜法始于1975年，系用具離子交換功能的有機聚合物載體或無機載體為填充劑，以稀堿溶液、碳酸鹽緩沖液為洗脫液，以電導(dǎo)檢測器、安培檢測器等來分析樣品中的陰離子或陽離子的色譜方法，具有操作簡單、選擇性好、靈敏度高、分析時間短、可同時測定多組分等特點[4]。離子色譜儀自問世以來發(fā)展迅速，在醫(yī)藥、食品、生物、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、電子等領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用，是高效液相色譜法的重要分支[5]。雖然離子色譜法在分析化學(xué)中發(fā)展很快，但相對于高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法等常用儀器分析方法，《中華人民共和國藥典》自2010年才將其首次收載，2015年修訂后收錄至四部通則。在其他各國藥典中，《英國藥典》最先將離子色譜法作為各類品種測定方法收載，隨后《美國藥典》、《歐洲藥典》等也先后收載[6]。

在中國藥典委員會2017年6月發(fā)布的《關(guān)于那屈肝素鈣國家標準的公示》里，游離硫酸鹽的含量測定采用離子色譜法，但《中國藥典》2015版里對于氯化物的檢查采用比色法[7]，存在操作步驟繁瑣、靈敏度較低以及抗干擾能力較差等缺點。離子色譜法作為一種新興的分析技術(shù)[8]，在各個行業(yè)都已得到廣泛應(yīng)用的同時，具備同時進行多種離子分析的特點[9-14]，而且靈敏度高、分析速度快。本文采用標準曲線法，建立了一種離子色譜法同時測定那屈肝素鈣中氯離子和硫酸根離子含量的方法，該法簡便、可靠，靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-6000離子色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司，配有淋洗液發(fā)生器)，色譜柱(賽默飛世爾科技有限公司，強陰離子交換柱AS22)；硫酸根溶液標準物質(zhì)(GBW(E)080266，標準值：1 000 μg/mL)，氯單元素溶液標準物質(zhì)(GBW(E)082515，標準值：1 000 μg/mL)，那屈肝素鈣(批號191119)。

1.2 色譜條件

色譜柱：強陰離子交換柱(賽默飛世爾科技有限公司，AS22，4.0 mm×250 mm)；流動相：3 mmol/L碳酸鈉溶液；流速：2.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：25 μL；檢測器：配有化學(xué)抑制器的電導(dǎo)檢測器。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的制備

準確移取氯標準溶液1.00 mL和硫酸根標準溶液1.00 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用水稀釋成含氯離子和硫酸根離子20.00 μg/mL的混合溶液，并依次稀釋制成含氯離子和硫酸根離子為10.00、5.00、2.00、1.00 μg/mL的系列濃度對照品溶液，每次測試以流動相為空白溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取那屈肝素鈣約25 mg(精確至0.1 mg)，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋制成2.5 mg/mL的溶液，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。平行制備兩份。

1.4 系統(tǒng)適用性實驗

精密量取“對照品溶液的制備”項下含氯離子和硫酸根離子濃度為5 μg/mL的對照品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，氯離子峰與硫酸根離子峰能徹底分開，其中氯離子峰塔板數(shù)為7234，硫酸根離子峰塔板數(shù)為8405，分離度為14.18。

1.5 供試品含量測定

精密量取“對照品溶液的制備”項下系列濃度對照品溶液各25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線并計算線性回歸方程。取那屈肝素鈣2份，精密稱定，照“供試品溶液的制備”項下方法制備，各精密量取25 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖，用線性回歸方程計算供試品中氯離子和硫酸根離子的含量。結(jié)果表明，191119批含氯離子0.069%，含硫酸根離子0.028%。實驗結(jié)果見表1。

表1 供試品中氯離子和硫酸根離子的含量Table 1 The content of chloridion and sulfate ion in the tested sample

2 結(jié)果討論

2.1 色譜柱的選擇

本實驗分別考察了AS11、AS14、AS19、AS22等四種強陰離子交換色譜柱，其中AS11與AS19色譜柱為氫氧化物淋洗液選擇性陰離子交換色譜柱，實驗發(fā)現(xiàn)，當使用3 mmol/L碳酸鈉溶液為流動相時，濃度為20 μg/mL的對照品溶液色譜圖中氯離子峰不對稱度較大，峰形略有拖尾。AS14色譜柱具有出色的鹵化物保留能力，但實驗發(fā)現(xiàn)，硫酸根離子峰保留時間約為12.8 min，當樣品運行時間為15 min時，不能保證主峰后有足夠的時間來沖洗及平衡色譜柱，若加長運行時間則影響實驗效率。因此選擇AS22色譜柱，其氯離子和硫酸根離子分離度良好，主峰峰形不拖尾，且硫酸根保留時間為9.5 min左右，15 min便可完成樣品分析。

2.2 流速的選擇

分別考察了1.0、1.5、2.0 mL/min等不同流速對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當流速為1.0 mL/min和1.5 mL/min時，濃度為20 μg/mL的對照品溶液色譜圖中氯離子峰不對稱度分別為1.61和1.92；而流速為2.0 mL/min，不對稱度為1.19，峰形較好，不影響結(jié)果計算。因此，選擇流速為2.0 mL/min。

2.3 流動相及濃度的選擇

離子色譜法測定氯離子、硫酸根離子等無機強酸陰離子常用碳酸鈉溶液為流動相，分別考察了1、3、5 mmol/L等不同濃度碳酸鈉溶液流動相對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當碳酸鈉溶液濃度為1 mmol/L時，氯離子檢出限為0.1 μg/mL，而3 mmol/L時，氯離子檢出限為0.01 μg/mL；當碳酸鈉溶液濃度為5 mmol/L時，濃度為20 μg/mL的對照品溶液色譜圖中氯離子峰不對稱度為1.49，大于3 mmol/L時的1.19。因此，選擇3 mmol/L碳酸鈉溶液為流動相。

2.4 柱溫的選擇

實驗分別考察了25、30、35 ℃等不同柱溫對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明，不同溫度對實驗結(jié)果影響較小，但若柱溫不穩(wěn)定則會造成基線波動影響峰面積?？紤]到柱溫箱控溫能力，將柱溫定為30 ℃。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 系統(tǒng)適用性

精密量取“對照品溶液的制備”項下含氯離子和硫酸根離子濃度為5 μg/mL的對照品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進樣6次。結(jié)果表明，氯離子峰面積分別為0.654、0.655、0.645、0.643、0.640、0.652 μS·min，相對標準偏差為0.99%；硫酸根離子峰面積分別為0.599、0.579、0.586、0.582、0.591、0.599 μS·min，相對標準偏差為1.20%。RSD均小于2.0%，該方法系統(tǒng)適用性良好。實驗結(jié)果見表2。

表2 系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果Table 2 The result of system suitability test

2.5.2 專屬性

精密量取空白溶劑25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖；精密量取“對照品溶液的制備”項下含氯離子和硫酸根離子濃度為5.00 μg/mL的對照品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑色譜圖中，除基線噪音外，未見明顯色譜峰；5 μg/mL 的對照品溶液色譜圖中，氯離子峰保留時間為3.692 min，硫酸根離子峰保留時間為9.522 min。氯離子峰與硫酸根離子峰能徹底分離，且空白溶劑對氯離子峰和硫酸根離子峰均不干擾，該方法專屬性良好。實驗結(jié)果見表3。

表3 專屬性實驗結(jié)果Table 3 The result of specificity test

2.5.3 準確度實驗

精密量取氯標準溶液和硫酸根標準溶液各1.00 mL，置于同一20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，制成含氯離子和硫酸根離子濃度分別為50.00 μg/mL的溶液，作為準確度實驗儲備溶液。取那屈肝素鈣樣品約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，平行9份，其中3份加入儲備溶液0.8 mL，3份加入儲備溶液1 mL，3份加入儲備溶液1.2 mL，用水稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液作為準確度實驗供試品溶液。精密量取各準確度實驗供試品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，9份供試品氯離子平均回收率為101%，RSD為2.0%；硫酸根離子平均回收率為101%，RSD為2.1%；該方法準確度良好。實驗結(jié)果見表4和表5。

表4 氯離子準確度實驗Table 4 The result of accuracy test of Cl-

表5 硫酸根離子準確度實驗Table 5 The result of accuracy test of SO42-

2.5.4 精密度實驗

照“供試品溶液的制備”項下方法，取那屈肝素鈣約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋制成2.5 mg/mL的溶液，過濾，取續(xù)濾液作為精密度實驗供試品溶液，平行操作6份。精密量取各精密度實驗供試品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，6份供試品氯離子含量RSD為2.8%，硫酸根離子含量RSD為5.8%。該方法精密度良好。實驗結(jié)果見表6。

表6 精密度實驗結(jié)果Table 6 The result of precision test

2.5.5 檢出限與定量限

精密量取“對照品溶液的制備”項下含氯離子和硫酸根離子濃度為1.00 μg/mL的對照品溶液適量，依次稀釋成含氯離子和硫酸根離子濃度分別為0.1、0.01 μg/mL的溶液，作為檢出限實驗供試品溶液。精密量取各檢出限實驗供試品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，當濃度為0.01 μg/mL時，氯離子信噪比為3.8，硫酸根離子信噪比為10.6。因此，該方法氯離子和硫酸根離子的檢出限為0.01 μg/mL。實驗結(jié)果見表7。

表7 檢出限實驗結(jié)果Table 7 The result of LOQ test

因該方法結(jié)果計算為標準曲線法，故該方法氯離子和硫酸根離子的定量限為標準曲線溶液的最小濃度，即1.00 μg/mL。

2.5.6 線性范圍

精密量取“對照品溶液的制備”項下各濃度對照品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在1～20 μg/mL的范圍下，氯離子線性方程為y=0.131 4x-0.008 1，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9；硫酸根線性方程為y=0.123x-0.009 8，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。該方法線性關(guān)系良好。實驗結(jié)果見圖1。

圖1 氯離子(a)與硫酸根離子(b)的線性回歸方程Figure 1 Linear regression equation of Cl-(a)and SO42-(b).

2.5.7 溶液穩(wěn)定性

按照“供試品溶液的制備”項下方法，取那屈肝素鈣約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋制成2.5 mg/mL的溶液，過濾，取續(xù)濾液作為溶液穩(wěn)定性實驗供試品溶液。分別于0、1、2、4、8、12、24 h時精密量取溶液穩(wěn)定性實驗供試品溶液25 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，氯離子峰面積分別為0.199、0.192、0.195、0.198、0.201、0.195、0.196 μS·min，RSD為1.5%；硫酸根離子峰面積分別為0.080、0.075、0.077、0.082、0.082、0.077、0.079 μS·min，RSD為3.4%。供試品溶液穩(wěn)定性良好。實驗結(jié)果見表8。

表8 溶液穩(wěn)定性實驗Table 8 The result of solution stability test

2.5.8 耐用性

同時也考察了流速、流動相濃度、柱溫等色譜條件有小的變動后，對5 μg/mL的對照品溶液的色譜峰結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當流速為1.8 mL/min時，氯離子峰和硫酸根離子峰略有拖尾，峰面積RSD較大；而流動相濃度和柱溫小的變動能滿足系統(tǒng)適用性要求。實驗結(jié)果見表9。

表9 耐用性實驗結(jié)果Table 9 The result of durabiLity test

3 結(jié)論

本文初次將離子色譜法應(yīng)用于同時測定那屈肝素鈣中的氯離子和硫酸根離子的含量，一份溶液同時測定，很好地解決了傳統(tǒng)方法費時、不能同時測定兩種離子的問題。方法操作簡便，穩(wěn)定性好，結(jié)果準確可靠，實驗過程綠色無污染，該方法可作為那屈肝素鈣中氯離子和硫酸根離子測定的質(zhì)量控制方法。