趙永強(qiáng)，吳艷虹，韋 韜，叢 麗，岳志剛，肖家美，邵西群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130112)

反向遺傳學(xué)與經(jīng)典遺傳學(xué)相對(duì)而言，經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的表型、性狀的改變出發(fā)，研究其相對(duì)的基因特征，反向遺傳學(xué)則從生物的基因著手，研究基因的改變對(duì)生物表型、性狀的影響。反向遺傳學(xué)操作技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，尤其是病毒的反向遺傳學(xué)操作，狹義的反向遺傳學(xué)僅僅是微生物的感染性分子克隆構(gòu)建。病毒反向遺傳學(xué)是通過(guò)體外構(gòu)建DNA或者RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒DNA或者cDNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行基因敲除、置換等體外人工操作，也被稱為“病毒拯救”[1]。許多病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)已建立，成功實(shí)現(xiàn)體外病毒拯救。應(yīng)用體外基因突變、基因插入或者缺失和基因置換來(lái)研究生物基因結(jié)構(gòu)和功能都是在反向遺傳學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的，目前研究較熱的基因敲除、RNA干擾等等都是反向遺傳技術(shù)的延伸。反向遺傳操作技術(shù)在病毒上的應(yīng)用，推動(dòng)了基因缺失疫苗、標(biāo)記疫苗的研制，構(gòu)建嵌合體病毒、突變病毒等。

1 病毒反向遺傳學(xué)研究的發(fā)展

1.1 RNA病毒的反向遺傳操作技術(shù)

RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)是以構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆為基礎(chǔ)的。由于RNA病毒自身遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定，反向遺傳學(xué)操作的核酸為DNA，因此，獲得病毒全基因組序列的逆轉(zhuǎn)錄DNA成為該項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。正鏈RNA病毒的主要研究思路是用RT-PCR技術(shù)，采用“分段克隆”的方式，將病毒基因組各片段按原順序依次克隆到復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高的克隆載體上，通過(guò)載體構(gòu)建將RNA聚合酶的啟動(dòng)元件插入病毒全長(zhǎng)cDNA分子克隆中，同時(shí)在構(gòu)建的載體上引入一處或多處沉默突變，便于鑒定拯救的病毒，體外轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞或侵染宿主，拯救出與親代病毒相似的子代病毒[1]。逆轉(zhuǎn)錄DNA克隆的準(zhǔn)確性和完整性是RNA病毒拯救的關(guān)鍵，決定著病毒拯救的效率。對(duì)于負(fù)鏈RNA病毒，其cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA或者裸露的負(fù)鏈RNA不具有感染性，必須與依賴性聚合酶、核衣殼蛋白等形成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)才可以進(jìn)行病毒的正常復(fù)制與衣殼蛋白的組裝。因此，針對(duì)負(fù)鏈RNA病毒(如狂犬病毒)，構(gòu)建感染性分子克隆不僅需要構(gòu)建全長(zhǎng)的cDNA質(zhì)粒，還需要構(gòu)建RNA復(fù)制酶的相關(guān)輔助質(zhì)粒。

1.2 DNA病毒反向遺傳操作技術(shù)

DNA病毒的反向遺傳相對(duì)于RNA病毒發(fā)展得更早、更成熟，并且進(jìn)步也相對(duì)更快一些。通常情況下，將病毒全長(zhǎng)基因組克隆到載體上，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的宿主，即可實(shí)現(xiàn)病毒的拯救[1]。許多DNA病毒反向遺傳學(xué)平臺(tái)都已經(jīng)建立，如雙鏈DNA病毒皰疹病毒、腺病毒，以及單鏈DNA病毒圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒等，而對(duì)于有些DNA病毒,由于基因組存在特殊的結(jié)構(gòu)，比如細(xì)小病毒末端存在ITR回文序列，其感染性克隆構(gòu)建報(bào)道相對(duì)較少。

2 細(xì)小病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)概述

2.1 細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)

細(xì)小病毒是線性、單鏈DNA病毒，無(wú)囊膜，基因組長(zhǎng)約4 kb～6.3 kb，它是等軸對(duì)稱DNA病毒中最小病毒之一，分子質(zhì)量約1.5×103～2.0×103ku，G+C含量約為40%～50%，末端存在120 nt～550 nt的回文序列，這些回文序列可以折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，病毒的3′端成Y型或者T型結(jié)構(gòu)，5′端成U型結(jié)構(gòu)，對(duì)病毒的復(fù)制起著至關(guān)重要的作用。X射線晶體學(xué)研究明確了細(xì)小病毒顆粒為20面體結(jié)構(gòu)。大部分的細(xì)小病毒具有2種～4種病毒殼粒蛋白，而簡(jiǎn)短濃核病毒屬(Brevidensovirus)和環(huán)星黑煙濃核病毒屬 (Pefudensovirus)則有5種病毒殼粒蛋白 (VP1-VP5)。細(xì)小病毒有左、右兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(L-ORF、R-ORF)，其中L-ORF通過(guò)可變剪接編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS,R-ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP[2-3]。

細(xì)小病毒科又分為細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)和濃核病毒亞科(Densovirinae)，細(xì)小病毒亞科可感染脊椎動(dòng)物，廣泛存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)，可感染貓科、犬科、豬科、?？啤Ⅷ喛?、鼬科等動(dòng)物，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)養(yǎng)殖，而濃核病毒亞科可感染節(jié)肢動(dòng)物。許多細(xì)小病毒由于沒(méi)有適于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系，如多種阿留申病毒，難以在體外傳代增殖，所以其生物學(xué)特性的研究需要依靠反向遺傳操作技術(shù)輔助完成。

2.2 細(xì)小病毒滾動(dòng)復(fù)制機(jī)制

細(xì)小病毒主要為自主復(fù)制型病毒。因?yàn)榧?xì)小病毒在宿主細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，只有當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)入S期時(shí)，病毒才會(huì)利用宿主 DNA 聚合酶和其他細(xì)胞成分，隨著細(xì)胞增殖而復(fù)制。由于細(xì)小病毒基因組3′末端自我互補(bǔ)序列可以折疊的緣故，其DNA復(fù)制過(guò)程不需要環(huán)化或者 RNA 引物，是以其基因組3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′-OH 做為病毒復(fù)制的引物、線性化 DNA 親代鏈作為模板，合成基因組的互補(bǔ)鏈，形成復(fù)制中間體RF。NS1蛋白在復(fù)制早期生成，具有切割酶、解旋酶的活性[4]，切割親代 DNA 鏈，再次暴露子代 DNA 鏈的3′-OH，復(fù)制得以繼續(xù)，此時(shí)在NS1蛋白的解旋酶作用下，5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，再次做為復(fù)制模板。最后，親代鏈和子代鏈各自利用各自的回文結(jié)構(gòu)形成末端 ITR。新的子代 DNA 既可包裝衣殼形成病毒粒子，也可作為模板繼續(xù)復(fù)制。這是細(xì)小病毒滾動(dòng)復(fù)制的全部過(guò)程，其滾動(dòng)式復(fù)制的特點(diǎn)：一是病毒基因組3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)揮類似引物的功能，開(kāi)始病毒復(fù)制；二是病毒復(fù)制中間體 RF 的兩條鏈均可以作為下一輪復(fù)制的模板；三是病毒基因組3′和5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)形成“Y”/“T”和“U”型結(jié)構(gòu)，而不同種屬的細(xì)小病毒末端基因組序列以及形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)也存在差異[5]。高度變異的肉食動(dòng)物阿留申病毒屬不同毒種病毒的末端序列也存在差異，獲知存在復(fù)雜結(jié)構(gòu)的末端序列不易。

2.3 細(xì)小病毒反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建策略

由于細(xì)小病毒基因組末端存在穩(wěn)定的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不容易獲取末端序列，導(dǎo)致克隆細(xì)小病毒全基因組存在很大困難。

目前，構(gòu)建細(xì)小病毒全基因組感染性克隆通常分為三個(gè)步驟：首先，采用分段擴(kuò)增的方法獲得覆蓋全基因組的多個(gè)DNA片段；然后，利用體外連接的方法，將各個(gè)DNA片段連接起來(lái)，克隆到載體上，獲得全長(zhǎng)基因組DNA；最后，將獲得的全長(zhǎng)DNA轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞，并對(duì)拯救病毒的毒力、感染性以及免疫原性進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)小病毒亞科不同屬的成熟病毒顆粒優(yōu)先包裝單股正鏈或負(fù)鏈DNA，對(duì)于細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，本屬大多數(shù)成員的成熟病毒顆粒中主要為負(fù)鏈DNA，如水貂阿留申病毒(AMDV)顆粒中95%為負(fù)鏈，鼠細(xì)小病毒(MVM)顆粒中99%為負(fù)鏈，病毒顆粒中有1%～50%包裝單股正鏈DNA；對(duì)于依賴病毒屬(Dependovirus),包裝正鏈DNA和負(fù)鏈DNA的成熟病毒顆粒比例相等，如腺相關(guān)病毒AAV、AAV2，紅病毒屬(Erythrovirus)的人細(xì)小病毒(B19V)與AAV相同。所以，將目的片段克隆到載體時(shí)，應(yīng)注意目的片段屬于正鏈亦或是負(fù)鏈，正鏈DNA和負(fù)鏈DNA連接到載體復(fù)制原點(diǎn)后的方向應(yīng)該相反。

2.3.1 分段克隆 反向遺傳操作技術(shù)的關(guān)鍵步驟是獲得病毒全基因組克隆，許多研究者均采用分段克隆的策略，即將包含病毒全基因組的各個(gè)DNA片段依次克隆到載體上。同時(shí)在基因組合適的位置引入一處或者多處無(wú)義突變，便于鑒定和拯救病毒。細(xì)小病毒單鏈末端的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難通過(guò)常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，研究者采用多種方法獲得病毒基因組末端序列。水貂阿留申病毒(AMDV)細(xì)小病毒全基因組在1990年被第一次測(cè)通。隨著PCR、測(cè)序技術(shù)和人工合成基因片段技術(shù)的成熟，一部分研究者通過(guò)末端變性后分段PCR，將末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列準(zhǔn)確測(cè)序，并通過(guò)人工合成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列。有研究根據(jù)人博卡病毒(HBoV1)復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生的頭-尾連接的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)頭-尾連接的頭部結(jié)構(gòu)中包含兩段序列，這兩段序列和牛乳頭狀瘤病毒(BPV1)的3′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)中部分序列相同，于是根據(jù)頭部序列設(shè)計(jì)下游引物，根據(jù)BPV1 3′末端序列設(shè)計(jì)上游引物，成功擴(kuò)增出HBoV1 3′末端發(fā)夾序列，接著還發(fā)現(xiàn)頭-尾連接處的尾部結(jié)構(gòu)中也包含一段序列，該段序列被證實(shí)和犬博卡病毒(BoV)的5′末端發(fā)夾部分序列相同，因此他們推測(cè)HBoV1 5′末端發(fā)夾序列和MVC 5′末端發(fā)夾序列相似，因此針對(duì)該序列設(shè)計(jì)上下游引物擴(kuò)增出HBoV1 5′末端發(fā)夾序列，并通過(guò)人工合成了末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列[6]。用人工合成法合成并克隆MEV基因組的3′末端(約220 bp)、5′末端(約200 bp)，然后用PCR技術(shù)分段擴(kuò)增基因組中間序列，并通過(guò)重疊PCR進(jìn)行連接得到中間序列約4 700 bp[7]。在兩末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)處各設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件使末端發(fā)卡結(jié)構(gòu)變性，克服末端復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并通過(guò)分段 PCR成功擴(kuò)增出CPV末端發(fā)夾序列，再連接 T 載體測(cè)序，最后通過(guò)人工合成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，將細(xì)小病毒全基因測(cè)序過(guò)程簡(jiǎn)化，更便于細(xì)小病毒感染性克隆的構(gòu)建[8]；采用末端變性[9-10]，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，成功擴(kuò)增出AMDV-BJ株末端發(fā)夾序列，與AMDV末端序列同源性高，獲得FPV的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列。有研究建立一種快速構(gòu)建豬細(xì)小病毒(PPV)感染性克隆的方法[11]，采用分段擴(kuò)增末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列并測(cè)序，然后人工合成末端序列連接到載體pBlueScript Ⅱ SK(+)。用人工合成兩末端片段[12]，并組裝到低拷貝質(zhì)粒構(gòu)建pKQLL(F1+F2)，然后設(shè)計(jì)2對(duì)分別帶有Flag和His標(biāo)簽的引物來(lái)擴(kuò)增中間區(qū)域序列，獲得帶有標(biāo)簽的F3和F4中間片段。在發(fā)夾結(jié)合的位置設(shè)計(jì)引物，采用PCR分段擴(kuò)增末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，對(duì)樣品DNA進(jìn)行變性預(yù)處理，使其發(fā)夾結(jié)構(gòu)充分打開(kāi)并保持單鏈形式，便于與引物結(jié)合，對(duì)有效引發(fā)擴(kuò)增非常重要。另外，利用人工合成的方法，將3′和5′端單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列合成為dsDNA序列較短片段拼接連接載體更為準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)。

在構(gòu)建番鴨細(xì)小病毒(MDPV)ZW株全長(zhǎng)質(zhì)粒時(shí)，將ZW毒株在鴨胚中大量繁殖，并利用差速離心和超速離心法純化病毒，提取單鏈DNA病毒(ssDNA)，然后95℃保持5min再緩慢降溫到55℃退火，以致形成雙鏈型DNA(dsDNA)，最后利用XbaI酶切獲得的dsDNA分別產(chǎn)生兩段包含3′、5′末端ITR序列的亞基因片段[13]。

2.3.2 拼接全長(zhǎng)DNA片段 獲得覆蓋細(xì)小病毒全長(zhǎng)基因組的各個(gè)亞克隆以后，即可將其拼接組合成全長(zhǎng)病毒基因組DNA的質(zhì)粒。但應(yīng)值得注意的是，細(xì)小病毒末端回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)其復(fù)制過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，因此在構(gòu)建細(xì)小病毒感染性克隆時(shí)應(yīng)獲得完整的末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，由于很難通過(guò)常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，有些研究者通過(guò)末端變性PCR方法克隆末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，也有用人工合成末端發(fā)夾序列，然后通過(guò)無(wú)縫克隆技術(shù)將細(xì)小病毒病末端和中間非編碼區(qū)序列連接起來(lái)。在拼接全長(zhǎng)DNA片段時(shí)載體的選擇也很關(guān)鍵，構(gòu)建單鏈DNA病毒感染性克隆時(shí)應(yīng)選擇穿梭質(zhì)粒作為載體，同時(shí)載體的拷貝數(shù)不應(yīng)太高，在構(gòu)建鵝細(xì)小病毒(GPV)全長(zhǎng)質(zhì)粒時(shí)[14]，最先選用高拷貝的質(zhì)粒作為載體，但含有完整末端ITR全長(zhǎng)質(zhì)粒在E.coliSure 感受態(tài)細(xì)胞中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，換用低拷貝的載體后則成功轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞。穿梭質(zhì)粒載體具有兩個(gè)不同復(fù)制起點(diǎn)，可以在原核和真核細(xì)胞兩個(gè)不同類群宿主中復(fù)制和表達(dá)，如pBluescript Ⅱ SK(+)載體，其具有pUC和f1(+)兩個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，pUC方向允許dsDNA在大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞后則利用f1(+)方向復(fù)制起點(diǎn)產(chǎn)生病毒ssDNA，類似病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制表達(dá)。

在拼接AMDV全基因組質(zhì)粒時(shí)，選用pGEM3載體作為表達(dá)載體，用HindⅢ和EcoRⅠ酶對(duì)獲得的含有3′末端片段的載體進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生兩個(gè)粘性末端，同時(shí)用這兩種酶對(duì)pGEM3載體進(jìn)行雙酶切，將含有3′末端的片段導(dǎo)入酶切后的pGEM3載體，然后用EcoRⅠ酶將導(dǎo)入3′末端片段的載體線性化，同時(shí)用EcoRⅠ酶切含有5′末端雙鏈基因組序列的載體，最后將含有3′末端和5′末端的雙鏈基因組序列進(jìn)行拼接，并將完整的AMDV雙鏈基因組序列導(dǎo)入pGEM3載體，即獲得AMDV全長(zhǎng)質(zhì)粒。隨著無(wú)縫克隆技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，許多研究者開(kāi)始采用無(wú)縫克隆技術(shù)進(jìn)行全基因組序列的拼接，在構(gòu)建MEV全基因組質(zhì)粒時(shí)，選擇pBluescript Ⅱ SK(+)載體作為表達(dá)載體，并將載體中的酶切位點(diǎn)改造為克隆所需的酶切位點(diǎn)，然后采用In-Fusion無(wú)縫克隆技術(shù)將人工合成的末端序列和中間非編碼區(qū)序列進(jìn)行無(wú)縫拼接，獲得麻疹病毒(MeV)基因組全長(zhǎng)序列，最后將其克隆到經(jīng)過(guò)改造之后的pBluescript Ⅱ SK(+)載體上，獲得MeV全長(zhǎng)質(zhì)粒[7]。根據(jù)GenBank上公布的CPV Y1毒株序列， 將人工合成的3′和5′端dsDNA序列和PCR分段擴(kuò)增CPV/BJL1基因組約4 700 bp的中間區(qū)域序列，用重疊PCR技術(shù)將3個(gè)片段連接起來(lái)，成功獲得CPV全基因組序列[15]。在拼接PPV全長(zhǎng)質(zhì)粒時(shí)也是用In-fusion無(wú)縫克隆技術(shù)[11]，將中間片段(PM)導(dǎo)入質(zhì)粒p(FI)構(gòu)建質(zhì)粒p(FM+FI),最后將FⅡ片段導(dǎo)入質(zhì)粒p(FM+FI)，即獲得了全長(zhǎng)質(zhì)粒pPPV?？寺∫恢晁醢⒘羯瓴《局?AMDV-125)全基因組，并將全基因組導(dǎo)入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,該載體亦為穿梭質(zhì)粒載體，構(gòu)建了全基因核酸疫苗(pcDNA3.1-AMDV)，并在此基礎(chǔ)上又構(gòu)建了基因缺失疫苗，經(jīng)驗(yàn)證此疫苗免疫水貂能產(chǎn)生AMDV抗體，起到部分保護(hù)作用[16]。另外，構(gòu)建感染性克隆還需要選擇合適的感受態(tài)細(xì)胞，目前常用的感受態(tài)細(xì)胞為E.coliHB101菌株。而在載體構(gòu)建過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到一些基因片段具有高度的重復(fù)，這類插入載體質(zhì)粒中的基因由于被細(xì)菌的重組酶系統(tǒng)和限制內(nèi)切酶識(shí)別作用，產(chǎn)生高頻率插入基因的片段的缺失和重排，使其在細(xì)菌中擴(kuò)增不穩(wěn)定，因此，在質(zhì)粒擴(kuò)增過(guò)程可以嘗試使用重組酶和限制性內(nèi)切酶缺陷的大腸埃希氏菌菌株，如Sure菌株。選擇pBBSmaI載體作為表達(dá)載體，pBBSmaI載體是經(jīng)過(guò)在pProEX HTb載體中插入一系列酶切位點(diǎn)改造而來(lái)，所有的克隆工作是在E.coli感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行,成功構(gòu)建了HBoV1全基因組質(zhì)粒[6]。將構(gòu)建的番鴨細(xì)小病毒FZ91-30全長(zhǎng)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH5α和Sure菌株中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性質(zhì)粒能夠在Sure細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，而DH5α中的陽(yáng)性質(zhì)粒末端ITR發(fā)生了不同程度的缺失。說(shuō)明Sure菌株是經(jīng)過(guò)改造的特殊菌株，適用于有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的DNA片段的克隆，增強(qiáng)外源DNA的穩(wěn)定性，提高克隆效率[17]。

2.3.3 病毒的拯救 構(gòu)建病毒感染性分子克隆的關(guān)鍵步驟是獲得病毒的全基因組克隆，但獲得的病毒全基因組克隆需轉(zhuǎn)染易感宿主細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病毒的拯救。在過(guò)去，構(gòu)建的病毒全基因質(zhì)粒主要通過(guò)借助磷酸鈣或者DEAE-葡萄糖的生化方法轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的真核細(xì)胞中，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)的方法，將構(gòu)建的MeV全基因組質(zhì)粒導(dǎo)入CRFK細(xì)胞，成功拯救出病毒?，F(xiàn)在，很多研究者采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染易感宿主細(xì)胞，因?yàn)檫@種方法可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，并且脂質(zhì)這種類型的試劑能夠介導(dǎo)所有類型的核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入各種類型的宿主細(xì)胞，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)[6]，將構(gòu)建的HBoV1全長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，成功拯救出病毒；用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法[7]，將構(gòu)建的MeV全基因組質(zhì)粒導(dǎo)入F81細(xì)胞，成功拯救病毒；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法[15，18]，將構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入F81細(xì)胞，分別拯救出AMDV和CPV。有研究嘗試脂質(zhì)體介導(dǎo)和電穿孔等轉(zhuǎn)染細(xì)胞方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用細(xì)胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(AMAXA Cell Line Nucleofector system)轉(zhuǎn)染細(xì)胞效果最好，通過(guò)此方法將構(gòu)建的B19全基因組質(zhì)粒導(dǎo)入U(xiǎn)T7/Epo-S1細(xì)胞，拯救出B19病毒。

3 小結(jié)

反向遺傳操作技術(shù)為研究細(xì)小病毒生命活動(dòng)過(guò)程中的各種調(diào)控機(jī)制，如病毒的復(fù)制及致病性分子機(jī)理，提供了一個(gè)重要工具，特別對(duì)體外難以培養(yǎng)增殖的細(xì)小病毒的生物特征研究。反向遺傳操作技術(shù)通過(guò)體外基因的改造，對(duì)毒力基因的刪除，還可以用于新型疫苗株的篩選，同時(shí)還可以引入分子標(biāo)記以研制標(biāo)記疫苗。還可以通過(guò)構(gòu)建嵌合體病毒，進(jìn)一步研究病毒的復(fù)制及致病機(jī)制。細(xì)小病毒反向遺傳操作的構(gòu)建策略總體分為三步，首先分段克隆覆蓋細(xì)小病毒全基因組序列的DNA片段；然后將獲得的各個(gè)DNA片段進(jìn)行拼接，并與選擇的穿梭質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，獲得加載病毒全基因組的質(zhì)粒；最后用構(gòu)建的病毒全基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒易感的細(xì)胞，拯救病毒，并驗(yàn)證病毒感染性克隆是否構(gòu)建成功?？偟膩?lái)說(shuō)，構(gòu)建細(xì)小病毒感染性克隆的關(guān)鍵步驟在于獲取病毒的全基因組，其中難點(diǎn)在于獲得病毒3′和5′末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列，因此,開(kāi)發(fā)有效克隆末端未知復(fù)雜結(jié)構(gòu)序列的方法是順利開(kāi)展細(xì)小病毒全基因組序列感染性克隆構(gòu)建的關(guān)鍵。