陳華磊，黃克興，鄭 敏，楊朝霞

（青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100）

啤酒作為世界第三大飲品，其富含人體所需的各種氨基酸、維生素及營養(yǎng)成分[1-2]，被譽(yù)為“液體面包”，它具有促進(jìn)消化，增強(qiáng)脾臟活動(dòng)，增加食欲等功能[3]。感官風(fēng)味是啤酒重要的特征指標(biāo)，由于生產(chǎn)過程中所使用的原料及釀造工藝不同，導(dǎo)致不同品牌啤酒風(fēng)味上存在差異。消費(fèi)者則根據(jù)其喜好，選擇適合的產(chǎn)品以滿足身心愉悅的需求。因此，準(zhǔn)確區(qū)分不同品牌啤酒的特征風(fēng)味對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)化及真實(shí)性鑒別等研究存在重要意義。

眾所周知，不同品類啤酒（如Lager啤酒、小麥啤酒、黑啤酒、印度淡色艾爾啤酒等）間的風(fēng)味存在較大差異，很容易通過感官加以區(qū)分。而相同品類啤酒則辨識(shí)度不及前者，但酵母菌種及發(fā)酵工藝的差異也對(duì)它們之間的風(fēng)味造成細(xì)微差別，這些差異只有資深的忠實(shí)消費(fèi)者或?qū)I(yè)品評(píng)人員才有可能察覺。

近年來，頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)因具有良好的靈活性及選擇性[4-5]，被普遍應(yīng)用于食品及啤酒等酒精飲料的揮發(fā)物研究[6-10]。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展及高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）的廣泛應(yīng)用，啤酒風(fēng)味成分的檢測(cè)方法得到進(jìn)一步優(yōu)化，相關(guān)風(fēng)味差異分析的研究也取得了相應(yīng)進(jìn)展。HRMS的超低檢測(cè)限使其成為鑒定痕量物質(zhì)的首選。該技術(shù)已成為啤酒指紋識(shí)別及分類研究的有效工具[11-14]。

風(fēng)味組學(xué)[15]是繼基因組學(xué)[16]、蛋白組學(xué)[17]、代謝組學(xué)[18]、食品組學(xué)[19]及感官組學(xué)[20]后又一新興的研究領(lǐng)域，是系統(tǒng)風(fēng)味研究的重要組成部分，旨在分析樣品中全部小分子風(fēng)味化合物成分及其動(dòng)態(tài)變化。非靶向技術(shù)面向所有能檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)，全面反映整體風(fēng)味變化，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析篩選關(guān)鍵風(fēng)味標(biāo)記物。Gon?alves等[21]采用HS-SPME結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）及多元回歸分析建立啤酒原料中揮發(fā)物代謝組學(xué)的研究模式。Hughey等[22]利用高分辨質(zhì)譜及組學(xué)技術(shù)繪制了工坊啤酒的分子指紋圖譜，并利用建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)混合酒花釀造的IPA啤酒進(jìn)行預(yù)測(cè)。Harmonie等[23]對(duì)160 個(gè)品種的傳統(tǒng)啤酒大麥進(jìn)行非靶向組學(xué)分析，研究大麥品種對(duì)啤酒風(fēng)味的影響。Tomá?等[24]進(jìn)行捷克啤酒與捷克以外的其他歐洲啤酒的感官組學(xué)差異分析。

目前Lager啤酒仍然是啤酒消費(fèi)市場(chǎng)的主流品類，本研究選取國內(nèi)銷量最大、銷售范圍最廣的3 個(gè)品牌的Lager產(chǎn)品作為研究對(duì)象，利用HS-SPME-GC-MS結(jié)合風(fēng)味非靶向組學(xué)技術(shù)對(duì)其風(fēng)味差異進(jìn)行研究。將樣品的質(zhì)譜信息作為化學(xué)計(jì)量分析數(shù)據(jù)，利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）法及隨機(jī)森林分類（random forest classifier，RFC）法提取相關(guān)信息，再結(jié)合組學(xué)原理對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，并參照國際標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行鑒定。本方法對(duì)類似的飲料風(fēng)味的研究也同樣具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集國內(nèi)A、B、C 3 種品牌的8?P Lager成品啤酒各8 批次，共計(jì)24 批次（表1）作為樣品置于4 ℃冰箱冷藏，待分析檢測(cè)時(shí)回溫至室溫。

表 1 樣品信息Table 1 Information about samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維 美國Sigma-Aldrich公司；6890 GC/5975A GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

啤酒樣品排氣后，取4.5 mL置于20 mL頂空瓶中，預(yù)平衡1 min，室溫萃取5 min。為驗(yàn)證儀器的穩(wěn)定性，本方法將測(cè)試樣品按等比例混合配制成質(zhì)量控制樣品，與被測(cè)樣品同步進(jìn)行分析。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS條件

將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維在室溫條件下插入待測(cè)樣品的頂空瓶中進(jìn)行頂空微萃取5 min，再將萃取纖維插入GC-MS系統(tǒng)的進(jìn)樣口解吸5 min；使用HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行分離；載氣為He，流速1.3 mL/min。升溫程序：初始溫度30 ℃，保持2 min；然后以2 ℃/min升溫至45 ℃，并以3 ℃/min升溫速率升至120 ℃保持2 min；最終以6 ℃/min升至230 ℃保持5 min。

化合物通過5975A EI-MSD進(jìn)行質(zhì)量分析：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z29～550。將掃描所得質(zhì)譜圖與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院頒布的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫（NIST/EPA/NIH Mass spectral Library Version 2.2）進(jìn)行比對(duì)，鑒別關(guān)鍵揮發(fā)物。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將GC-MS原始文件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于全掃描取得的數(shù)據(jù)，首先使用OpenChrom Community Edition (Version 1.3.0)將原始文件轉(zhuǎn)換為CDF格式，并對(duì)其進(jìn)行過濾降噪，再利用解卷積功能對(duì)其進(jìn)行色譜峰的鑒定與積分。

使用R語言XCMS軟件包將已積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行樣本間色譜峰匹配、分組及保留時(shí)間校正與缺失峰填充，最終將得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)出。使用SIMCA-P（Version 14.1，Umetrics AB，Sweden）進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用PCA和PLS-DA構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。由于樣本數(shù)量的局限，選擇交叉驗(yàn)證（cross validation，CV）方法進(jìn)行模型驗(yàn)證。通過參數(shù)的置換測(cè)試及方差交叉驗(yàn)證分析（CVANOVA）計(jì)算特征變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）的不確定度，進(jìn)一步評(píng)估模型的有效性及穩(wěn)健性，并對(duì)VIP值進(jìn)行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品GC-MS測(cè)定

圖 1 3 種啤酒（A～C）及質(zhì)量控制樣品（D）的總離子色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of three beer samples and quality control sample

首先采用不解析化合物的方法[25]對(duì)樣品中檢出的組分進(jìn)行篩選。如圖1所示，樣品間的總離子流圖沒有視覺可見的明顯差異，很難通過傳統(tǒng)的GC-MS定性定量分析迅速直觀地確定其關(guān)鍵風(fēng)味化合物。

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言XCMS軟件包，進(jìn)行色譜峰識(shí)別、過濾及對(duì)齊處理，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)[26]，并得到包括質(zhì)荷比、保留時(shí)間及峰面積等信息在內(nèi)的數(shù)據(jù)矩陣。本研究最終獲得了1 751 個(gè)特征值，將其導(dǎo)出至Excel表格，再使用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA及PLS-DA，結(jié)合MetaboAnalyst軟件篩選風(fēng)味差異標(biāo)志物，并進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。在此過程中原始數(shù)據(jù)通過預(yù)處理轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的最佳替代模型。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后消除變量間量綱關(guān)系，為所有變量提供相似的權(quán)重，導(dǎo)致質(zhì)譜特征的響應(yīng)被均一化，因此來自低強(qiáng)度信號(hào)與高強(qiáng)度信號(hào)的相關(guān)信息以相同比例被測(cè)量。

2.2 PCA結(jié)果

本研究并未對(duì)所有組分進(jìn)行定性定量分析，而僅將不同樣品間差異顯著的組分進(jìn)行鑒別。GC-MS掃描的24 批次樣品，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最終將提取色譜峰響應(yīng)值形成矩陣，并導(dǎo)入SIMCA-P 14.1進(jìn)行PCA。

PCA用于初步篩查在全掃描模式下獲得的質(zhì)譜信息，原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS軟件包進(jìn)行峰識(shí)別、過濾、對(duì)齊等處理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行PCA，將Ctr模式處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到所有提取特征值的得分圖（圖2）。擬合后的方程提取了4 個(gè)主成分，包含原始數(shù)據(jù)中累計(jì)的信息，說明擬合度較好，但模型被解釋的總變量累計(jì)Q2=47.4%，這可能是受樣品化學(xué)組分及其基質(zhì)背景中高豐度化合物的影響，使主成分的響應(yīng)貢獻(xiàn)不明顯，不同品牌啤酒的信息可視化結(jié)構(gòu)差異不顯著，結(jié)果導(dǎo)致分布在得分圖中不同品牌的啤酒未能有效區(qū)分。

由圖2可知，質(zhì)量控制樣品的重復(fù)樣本間較為聚集，且位于得分圖中心原點(diǎn)附近，說明本實(shí)驗(yàn)方法及儀器設(shè)備較穩(wěn)定。此外，3 組樣品中除了A品牌的2 個(gè)樣品外，其他數(shù)據(jù)點(diǎn)都在95%的置信區(qū)間內(nèi)，將上述偏離值剔除，并進(jìn)一步進(jìn)行PLS-DA。

圖 2 全掃描模式下提取信息的主成分得分圖Fig. 2 PCA score plot for extracted data in full scan mode

2.3 PLS-DA結(jié)果

圖 3 PLS-DA得分圖（a）與檢驗(yàn)圖（b～d）Fig. 3 PLS-DA score plot (a) and permutation test graphs (b-d)

表 2 PLS-DA模型參數(shù)Table 2 Parameters of PLS-DA model

PCA只能反映樣品整體趨勢(shì)，不利于發(fā)現(xiàn)組間差異及具體化合物特征，因此需要通過PLS-DA更為準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，挖掘組間細(xì)微差異[27]。

為了選擇需要識(shí)別的標(biāo)記，建立有監(jiān)督的PLS-DA模型，分類信息被納入分析。用Ctr算法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，樣品的特征信息在PC1上被有效分離，其占總方差的46.7%。PC2累計(jì)顯著性信息為73.2%，呈現(xiàn)的此類差異主要與樣品的不同釀造工藝所產(chǎn)生的風(fēng)味指紋有關(guān)，因此可完成根據(jù)給定樣品特征的類別建模。與PCA相反PLS-DA以最大化分量獲得的方差構(gòu)建主成分，PLS-DA潛在變量用以解釋樣本的組間差異。PC1和PC2有效區(qū)分啤酒的類別，其分別解釋了46.4%和52.5%的數(shù)據(jù)差異。如圖3a所示，A樣品較松散的位于圖上方區(qū)域；而B樣品緊湊分布在左側(cè)區(qū)域；C樣品分布于右下側(cè)較寬的區(qū)域。B啤酒的數(shù)據(jù)集較A、C更為集中，說明此品牌啤酒的GC-MS特征指紋更加均勻分布，這一發(fā)現(xiàn)與A、C啤酒比B啤酒富含更多種類的風(fēng)味化合物一致。

本模型交叉驗(yàn)證確認(rèn)的22 個(gè)樣本都被正確分配，沒有假陽性或陰性的情況出現(xiàn)，具有良好的質(zhì)量。PLSDA模型擬合方程參數(shù)見表2。其中Q2=0.844，均大于0.5，CV-ANOVA=1.430 6，且各參數(shù)間差異較小，說明擬合方程較為可靠。由圖3a可知，樣品組間有明顯差異，組內(nèi)各數(shù)據(jù)點(diǎn)相對(duì)較為聚集，表明樣品間重復(fù)性好且較穩(wěn)定。

當(dāng)PLS-DA模型中的樣本數(shù)遠(yuǎn)低于變量時(shí)，容易出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。為了評(píng)估模型性能，進(jìn)行200 次置換檢驗(yàn)，如圖3b～d所示。其中所有的Q2點(diǎn)從左到右均低于最右端的原始Q2點(diǎn)，其回歸線截距值分別為（0.302，-0.603）、（0.949，-0.118）、（0.323，-0.591），且Q2均小于0，說明該模型有效可靠[28]，未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。

主成分得分圖的幾何分布僅給出了聚類趨勢(shì)，未能直接用于區(qū)分啤酒類別。結(jié)果顯示采用PLS-DA模型區(qū)分3 種品牌Lager啤酒間揮發(fā)物差異效果較理想。將模型中VIP值大于2，且P值小于0.05及倍數(shù)變化大于1.2的因子作為關(guān)鍵差異揮發(fā)物，如表3所示。

表 3 PLS-DA模型的關(guān)鍵化合物保留時(shí)間和m/z匹配Table 3 Retention time and m/z match of key compounds from PLS-DA model

2.4 RFC結(jié)果

RFC使用分類集合決策樹的策略，對(duì)每棵決策樹都通過從引導(dǎo)程序中隨機(jī)選擇特征產(chǎn)生每個(gè)樣本分支，類預(yù)測(cè)基于整體投票的多數(shù)。在決策樹構(gòu)造期間，采用重復(fù)抽樣技術(shù)從原始樣本中抽取一定數(shù)量的樣本，并根據(jù)其計(jì)算待估的統(tǒng)計(jì)量T，經(jīng)過N次重復(fù)抽樣，得到統(tǒng)計(jì)量T樣本方差。

本研究選擇A、B、C 3 種品牌Lager啤酒樣品建立RFC模型，并與PLS-DA結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證。圖4表明誤差率在400決策樹時(shí)已變得穩(wěn)定，“袋外”誤差[29]使用給定參數(shù)誤差為0，因此選擇使用500決策樹構(gòu)建RF分類器。

圖 4 隨機(jī)森林分類的累計(jì)錯(cuò)誤率Fig. 4 Cumulative error rates of RFC

RFC模型除了提供變量重要性的衡量指標(biāo)外（通過測(cè)量“袋外”誤差的增加評(píng)估其重要性），還可通過預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)標(biāo)記物重要性。圖5給出了本RFC模型排名前列的關(guān)鍵標(biāo)記物（表4），其順序按預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度降序排列，與PLS-DA選擇的關(guān)鍵標(biāo)記物（表3）相類似。

圖 5 關(guān)鍵化合物重要特征平均精度排名Fig. 5 Average precision of important features of key compounds in increasing order

表 4 關(guān)鍵化合物標(biāo)記特征平均精度排序Table 4 Key compounds listed in decreasing order of average accuracy of marker features

由表4可以看出，除十甲基環(huán)五硅氧烷是色譜柱流失及M174T2700、M159T2700因響應(yīng)值太低無法定性外，其他關(guān)鍵性組分多為脂肪酸及其乙酯。

2.5 模型對(duì)比

選取3 種品牌Lager啤酒的不同生產(chǎn)批次樣品分別建立PLS-DA及RFC模型，并對(duì)其進(jìn)行分類預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確度均為100%，如表5所示。辛酸乙酯、癸酸乙酯等物質(zhì)在上述2 個(gè)模型中對(duì)被研究樣品分類均有積極貢獻(xiàn)，同時(shí)驗(yàn)證了模型的有效性，可初步判斷此類物質(zhì)是區(qū)分本研究所選擇的3 種Lager啤酒現(xiàn)階段風(fēng)味特征的關(guān)鍵指標(biāo)。

表 5 RFC和PLS-DA模型對(duì)啤酒分類結(jié)果Table 5 Classification results of beer by RFC and PLS-DA models

3 結(jié) 論

利用感官品評(píng)結(jié)合GC、GC-MS對(duì)特定揮發(fā)性成分進(jìn)行定量分析是傳統(tǒng)啤酒風(fēng)味研究的范式，它促進(jìn)了人們對(duì)啤酒風(fēng)味的理解，在一定程度上取得了成功，但由于其僅關(guān)注直接產(chǎn)生感官刺激的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，而忽略了其他潛在的具有調(diào)節(jié)風(fēng)味活性的成分之間的相互作用，因此許多有用信息可能被忽略。本實(shí)驗(yàn)使用的非靶向風(fēng)味組學(xué)與數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)豐富了啤酒風(fēng)味解析的手段，對(duì)類似的飲料及酒類的風(fēng)味研究及產(chǎn)品真實(shí)性判別的方法研究也起到積極作用。隨著分析儀器技術(shù)的進(jìn)步可獲得更多維度的數(shù)據(jù)，為揭示啤酒中復(fù)雜風(fēng)味化合物之間的相互關(guān)系提供了更多手段，從而更好地理解整個(gè)啤酒釀造過程對(duì)風(fēng)味造成的影響。

本研究通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)啤酒中揮發(fā)物進(jìn)行表征、分類及多變量分析，證實(shí)了DVB/CAR/PDMS萃取纖維及室溫5 min的萃取條件可適用于啤酒中揮發(fā)物的差異化研究，其中發(fā)現(xiàn)的部分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。與之前對(duì)不同風(fēng)格啤酒[23]差異化組學(xué)分析相比本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相同品類啤酒風(fēng)味區(qū)分的研究，雖然僅使用3 種特定品牌的Lager啤酒作為研究對(duì)象，但在一定程度上說明了不同釀造條件（如原料成分、糖化條件及發(fā)酵工藝等）可造成成品啤酒風(fēng)味存在細(xì)微的差別。本方法也可設(shè)計(jì)針對(duì)每個(gè)工藝環(huán)節(jié)的特定樣本集，包括原料品種、種植環(huán)境及釀造過程中可能對(duì)成品風(fēng)味造成影響的因素。