程 超，夏蘭欣，杜芬妮，李 偉，田 成

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000）

香氣是評(píng)價(jià)和衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，同時(shí)也是指導(dǎo)消費(fèi)者進(jìn)行茶葉消費(fèi)的重要導(dǎo)向之一[1]，紅茶中風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量直接影響紅茶香氣和香型，因此紅茶風(fēng)味成分與香氣品質(zhì)的關(guān)系一直是茶葉科學(xué)的熱門(mén)研究領(lǐng)域，尤其是茶葉產(chǎn)地對(duì)風(fēng)味的影響受到了日益廣泛的關(guān)注，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同品種紅茶香氣具有特異性[2-3]。同種茶葉采用不同工藝，同一工藝?yán)貌煌霞庸ざ傻募t茶風(fēng)味不同，因此紅茶風(fēng)味與產(chǎn)地生態(tài)條件有很大關(guān)系，而風(fēng)味物質(zhì)可作為鑒別紅茶地理來(lái)源的指標(biāo)[4]。

Owuor等[5]通過(guò)比較世界主要紅茶香氣組分發(fā)現(xiàn)，紅茶香氣成分的重要風(fēng)味物質(zhì)可分為兩組，第1組包括反-2-己烯醛、己醛、1-戊烯-3-醇、順-3-己烯醛、順-2-戊烯醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、戊醇、正己醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛等；而苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、芳樟醇及氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇及β-紫羅酮等能給紅茶帶來(lái)花香，為第2組化合物。

目前普遍認(rèn)為氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是最為簡(jiǎn)便高效的分析鑒定茶葉風(fēng)味物質(zhì)的方法，但風(fēng)味提取是最為關(guān)鍵的一步[6]。偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)方法，該法可解釋樣品觀測(cè)數(shù)目少，減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響[7]。本法有利于對(duì)樣品不同產(chǎn)地[8-12]、不同加工方式[13-15]、不同質(zhì)量品質(zhì)[16-19]等的快速鑒別，此技術(shù)近幾年已經(jīng)廣泛應(yīng)用在代謝組學(xué)[20-22]和風(fēng)味組學(xué)[23]的研究中。

湖北恩施州利川紅茶已有170多年加工歷史，1951年利川被國(guó)家列為宜紅工夫紅茶主產(chǎn)區(qū)，2017年利川紅被國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，2018年擔(dān)任國(guó)賓用茶。近兩年利川紅發(fā)展迅速，但目前對(duì)利川紅風(fēng)味物質(zhì)的研究較少[24]，缺少有力的風(fēng)味品質(zhì)研究的基礎(chǔ)理論支撐，利川紅雖為宜紅主產(chǎn)區(qū)，但不同的地理位置賦予了利川紅特殊的風(fēng)味品質(zhì)，因此尚需深入研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Owuor理論首先確定利川紅中重要的風(fēng)味物質(zhì)，以此為基礎(chǔ)通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化其固相微萃取條件，同時(shí)對(duì)利川紅、宜紅、滇紅的風(fēng)味進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)OPLS-DA進(jìn)行風(fēng)味預(yù)測(cè)，以期為利川紅風(fēng)味品質(zhì)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利川紅：由利川市根之潤(rùn)飲料公司提供，一芽二葉，小葉種；滇紅：購(gòu)于恩施顏如玉茶葉公司，大葉種，一芽二葉；宜紅：購(gòu)于恩施顏如玉茶葉公司，小葉種，一芽二葉；所有紅茶粉碎成粉末過(guò)80 目篩，備用。

正構(gòu)烷烴（C8～C40）（色譜純，純度＞98.0%）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氯化鈉（分析純） 武漢市中天化工有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器 美國(guó)Supelco公司；頂空瓶（15 mL） 德國(guó)IKA公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 料液比對(duì)利川產(chǎn)區(qū)紅茶風(fēng)味物質(zhì)的影響

首先將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在250 ℃老化2 h，至無(wú)干擾峰出現(xiàn)為止，備用，下同。稱(chēng)取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專(zhuān)用頂空瓶中，分別按料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）加入60 ℃超純水，加入0.2 g NaCl，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上60 ℃水浴，插入已老化好萃取頭平衡10 min后推出纖維頭，萃取吸附50 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次[25]。

1.3.2 萃取溫度對(duì)利川產(chǎn)區(qū)紅茶風(fēng)味物質(zhì)的影響

稱(chēng)取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專(zhuān)用頂空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL超純水，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上水浴加熱，溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，插入已老化好的萃取頭平衡10 min后推出纖維頭萃取吸附50 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 萃取時(shí)間對(duì)利川產(chǎn)區(qū)紅茶風(fēng)味物質(zhì)的影響

稱(chēng)取1.00 g紅茶粉末于固相微萃取專(zhuān)用頂空瓶中，加入0.2 g NaCl和5 mL 70 ℃超純水，用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊立即密封，將固相微萃取頂空瓶置于磁力攪拌器上70 ℃水浴，插入已老化好萃取頭平衡10 min后推出纖維頭，分別萃取吸附20、30、40、50、60、70 min，移出萃取頭后立即插入GC-MS進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化萃取條件

選取萃取溫度、萃取時(shí)間和料液比3 個(gè)因素，利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1軟件，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 GC-MS檢測(cè)條件

GC條件[26]：DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度＞99.999%），流速為1 mL/min。程序升溫：起始溫度為40 ℃，保持5 min，隨后以3 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min，最后以15 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～450 u。

1.3.6 風(fēng)味成分分析

GC-MS測(cè)定的各揮發(fā)性組分通過(guò)NIST05-Wiley標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，在總離子流圖的色譜峰中挑選出匹配度不小于80，結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間，查閱有關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性，并根據(jù)香氣成分的峰面積值相對(duì)定量[27]。利用Design-Expert 10.0和Minitab 17.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA[28]，采用Origin 2018軟件進(jìn)行熱圖分析。

1.3.7 萜烯指數(shù)和保留指數(shù)計(jì)算

萜烯指數(shù)和保留指數(shù)按下式[29-30]計(jì)算：

式中：n為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx、tn、tn+1分別為物質(zhì)x和n、n+1碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 利川紅茶固相微萃取條件優(yōu)化

圖 1 利川紅茶風(fēng)味物質(zhì)固相微萃取的GC-MS總離子流圖Fig. 1 GC-MS total ion current chromatograms of aromatic components extracted from Lichuan Hong tea by SPME

如圖1所示，結(jié)合Owuor總結(jié)結(jié)果，選擇利川紅中匹配度不小于85的物質(zhì)如2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物、香葉醇、水楊酸甲酯、檸檬醛9 種物質(zhì)為利川紅的重要風(fēng)味物質(zhì)。茶葉香氣從基質(zhì)遷移至消費(fèi)者嗅覺(jué)器官除受茶葉本身內(nèi)在因素影響外，發(fā)香條件如茶葉萃取溫度、萃取時(shí)間等貢獻(xiàn)也較大[30-31]。因此為了優(yōu)化利川紅風(fēng)味成分的固相微萃取條件，考察料液比、萃取溫度、萃取時(shí)間3 個(gè)影響因素，以上9 種風(fēng)味物質(zhì)的峰面積為評(píng)定指標(biāo)。

2.1.1 利川紅固相微萃取的料液比優(yōu)化

圖 2 料液比對(duì)利川紅9 種風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig. 2 Influence of solid-to-liquid ratio on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由圖2可以看出，在60 ℃，9 種風(fēng)味物質(zhì)僅萃取了7 種，水楊酸甲酯和香葉醇并未萃取出來(lái)，7 種風(fēng)味物質(zhì)隨料液比減小峰面積不斷增加，尤其是2-己烯醛和順式芳樟醇氧化物顯著增加。順式芳樟醇氧化物具有花果香，而己烯醛呈現(xiàn)強(qiáng)烈青草氣，但稀釋后有清香的感覺(jué)，由此可見(jiàn)為使消費(fèi)者品嘗的紅茶風(fēng)味達(dá)到最好，不適宜使用過(guò)小料液比；同時(shí)料液比過(guò)大茶湯濃度過(guò)高，不能充分浸透茶葉，因此最佳料液比選擇1∶5（g/mL）。

2.1.2 利川紅萃取溫度優(yōu)化

圖 3 萃取溫度對(duì)利川紅9 種風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

由圖3可知，40 ℃時(shí)僅萃取了相對(duì)含量高的順式芳樟醇氧化物，隨溫度上升至50 ℃，苯乙醛、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇開(kāi)始出現(xiàn)，60 ℃時(shí)除水楊酸甲酯和香葉醇外的7 種風(fēng)味物質(zhì)均被萃取，溫度70 ℃時(shí)9 種風(fēng)味物質(zhì)全部萃取，繼續(xù)升高溫度這些物質(zhì)的萃取量有所下降，可能由于低溫分子熱運(yùn)動(dòng)不劇烈，風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)較慢；隨溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，高沸點(diǎn)物質(zhì)揮發(fā)，且揮發(fā)速度不斷增加。但過(guò)高溫度會(huì)使萃取頭固有成分解吸，降低吸附及解吸準(zhǔn)確率。因此最佳萃取溫度選擇70 ℃。

2.1.3 利川紅萃取時(shí)間優(yōu)化

圖 4 萃取時(shí)間對(duì)利川紅9 種風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of nine aroma compounds from Lichuan Hong tea

如圖4所示，當(dāng)萃取時(shí)間為20 min時(shí)，水楊酸甲酯和香葉醇無(wú)法萃取出來(lái)，隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)，水楊酸甲酯、香葉醇和其他7 種風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和峰面積均有所增加。綜合考慮最佳萃取時(shí)間選擇50 min。

2.1.4 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

以9 種重要風(fēng)味物質(zhì)總峰面積為響應(yīng)值（表2），利用Design-Expert軟件可擬合出3 個(gè)影響因素的回歸方程：

峰面積=5.08×109+0.33×109A+0.47×109B+0.005×109C-0.99×109A2-0.76×109B2-1.09×109C2-0.27×109AB+0.33×109AC+0.31×109BC

通過(guò)Design-Expert軟件分析可得出，此方程R2=0.974 4，調(diào)整R2為94.14%，說(shuō)明此方程可很好反映3 個(gè)影響因素對(duì)風(fēng)味物質(zhì)萃取的影響。利用Minitab 17.1軟件分析可得出紅茶的最佳萃取條件水平：A為0.107、B為0.350、C為0.029，即料液比1∶4.11（g/mL）、萃取溫度71.75 ℃、萃取時(shí)間50.15 min，此時(shí)9 種重要風(fēng)味物質(zhì)的峰面積為（5.172±0.075）×109，9 種風(fēng)味物質(zhì)均能萃取出來(lái)。

2.2 利川紅茶與宜昌、云南紅茶風(fēng)味物質(zhì)比較

2.2.1 3 種紅茶風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS測(cè)定結(jié)果

表 3 3種紅茶風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS成分鑒定Table 3 GC-MS analysis of aroma compounds in three black teas

續(xù)表3

續(xù)表3

由表3可以看出，3 種紅茶中共鑒定出124 種風(fēng)味物質(zhì)，宜紅、滇紅、利川紅鑒定的風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量分別為92.807%、81.529%、83.166%。從風(fēng)味物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)看，宜紅、滇紅風(fēng)味物質(zhì)中醇類(lèi)含量較高，呋喃類(lèi)、酯類(lèi)等在利川紅中含量較高，此外醛類(lèi)化合物在3 種紅茶中含量均較高。

2.2.2 3 種紅茶風(fēng)味成分相關(guān)性分析

萜烯指數(shù)是評(píng)價(jià)茶葉香氣品質(zhì)和特征的一個(gè)重要指標(biāo)，萜烯指數(shù)高，則香氣宜人，萜烯指數(shù)低，則香氣高銳[23]。宜紅、滇紅、利川紅萜烯指數(shù)分別為0.954、0.773、0.917，利用SPSS軟件進(jìn)行偏相關(guān)分析可得，宜紅、利川紅的萜烯指數(shù)的偏相關(guān)顯著性P值為0.023，這說(shuō)明二者香氣品質(zhì)相似，在0.05水平上顯著相關(guān)；而利川紅和滇紅偏相關(guān)顯著性P值為0.515，這說(shuō)明利川紅和滇紅的香氣品質(zhì)有差異。

圖 5 基于重要風(fēng)味物質(zhì)的3 種紅茶PLS-DA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 5 Score (A) and loading plots (B) of PLS-DA based on the important aroma compounds

為了更好地進(jìn)行3 種紅茶風(fēng)味識(shí)別，利用SIMCA 14.1軟件對(duì)表3的9 種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PLS-DA，結(jié)果見(jiàn)圖5。該建模方法能較好地區(qū)分3 種紅茶，其中和Q2分別為0.997、0.995、0.991，由圖5A可知，提取的2 個(gè)成分即可反映總體99.7%的原始變量信息，說(shuō)明這2 個(gè)成分可反映紅茶香氣的總體情況；在主成分1上，3 種紅茶的風(fēng)味品質(zhì)可很好區(qū)分，但利川紅和宜紅的差異性要弱于利川紅和滇紅，這與萜烯指數(shù)相關(guān)性分析和圖6結(jié)果一致。各主成分的載荷值代表該主成分對(duì)該類(lèi)物質(zhì)反映程度的大小。由圖5B可知，香葉醇、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物等物質(zhì)在第1主成分的載荷值較大；2-己烯醛、苯乙醛、檸檬醛、苯甲醛在第2主成分上的載荷值較大。

圖 6 3 種紅茶風(fēng)味物質(zhì)熱圖Fig. 6 Heat map of flavor components in three black teas

2.2.3 紅茶風(fēng)味成分變量投影重要度（variable importance in projection，VIP）結(jié)果

圖 7 基于重要風(fēng)味物質(zhì)3 種紅茶PLS-DA的VIP和置換圖Fig. 7 VIP and permutation test of PLS-DA model based on the important flavor compounds

如圖7所示，通過(guò)PLS-DA的VIP值分析可知，芳樟醇、2-己烯醛、順式芳樟醇氧化物、香葉醇對(duì)3 種紅茶風(fēng)味影響最大，VIP值均大于1，這幾種風(fēng)味成分可作為3 種紅茶相互區(qū)分的主要特征標(biāo)志物。通過(guò)交互殘差驗(yàn)證方差分析得PLS-DA的預(yù)測(cè)模型P值為1.057×10-6，說(shuō)明模型對(duì)3 種紅茶風(fēng)味預(yù)測(cè)能力較好。

2.2.4 紅茶風(fēng)味成分PLS-DA結(jié)果

圖 8 基于全部風(fēng)味物質(zhì)的PLS-DA得分圖Fig. 8 Score plot of PLS-DA based on all aroma compounds

以紅茶中全部風(fēng)味物質(zhì)為自變量，進(jìn)行PLS-DA，如圖8所示。擬合模型的Q2分別為0.977、0.988、0.979，這些參數(shù)均低于基于重要風(fēng)味物質(zhì)的PLS-DA模型；交互殘差驗(yàn)證方差分析得P值為2.422×10-5，大于基于9 種風(fēng)味物質(zhì)的模型參數(shù)，以上結(jié)果說(shuō)明以紅茶中9 種風(fēng)味物質(zhì)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，不僅可以進(jìn)行紅茶風(fēng)味類(lèi)型預(yù)測(cè)，而且優(yōu)于基于全部風(fēng)味物質(zhì)的預(yù)測(cè)能力。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)利川紅GC-MS總離子流圖，結(jié)合Owuor總結(jié)結(jié)果，選擇利川紅中匹配度不小于85的物質(zhì)2-己烯醛、苯甲醛、苯乙醛、芳樟醇、順式和反式芳樟醇氧化物、香葉醇、水楊酸甲酯、檸檬醛為利川紅的重要風(fēng)味物質(zhì)。以此9 種風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和萃取峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化固相微萃取條件，確定最優(yōu)料液比1∶4.11（g/mL）、萃取溫度71.75 ℃、萃取時(shí)間50.15 min，此時(shí)9 種重要風(fēng)味物質(zhì)的峰面積為（5.172±0.075）×109。

基于利川紅最優(yōu)萃取條件，比較分析利川紅、宜紅、滇紅的風(fēng)味差異。利川紅鑒定出的73 種風(fēng)味物質(zhì)中，以呋喃類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)為主，相對(duì)含量分別為21.202%和20.11%，其次是烷烴和酯類(lèi)，相對(duì)含量分別為13.751%和11.662%。宜紅鑒定出59 種風(fēng)味物質(zhì)，呋喃、醇類(lèi)、醛類(lèi)和烷烴，相對(duì)含量分別為23.445%、21.04%、19.816%和18.070%。滇紅茶鑒定出66 種風(fēng)味物質(zhì)，醇類(lèi)、醛類(lèi)、呋喃類(lèi)，相對(duì)含量分別為35.587%、15.103%和12.229%。

竹尾忠一等[29]將紅茶分為3 種主要香氣類(lèi)型：第1種是以芳樟醇占優(yōu)勢(shì)型，第2種是中間型，含有芳樟醇和香葉醇，第3 種是香葉醇占優(yōu)勢(shì)型。香葉醇在宜紅、滇紅和利川紅的相對(duì)含量分布分別為1.215%、7.667%和1.736%，而芳樟醇及其氧化物的相對(duì)含量分別為25.279%、26.151%和19.246%；利川紅、宜紅中芳樟醇及其氧化物含量遠(yuǎn)高于香葉醇，因此屬于第1種香型，而滇紅香葉醇相對(duì)含量達(dá)到了7.667%，屬于中間香型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有別于其他研究者[24]，特別是香葉醇的含量差異較大，也可能與選取的樣品有關(guān)[32]，如所選茶葉的原料產(chǎn)地、茶葉等級(jí)、茶葉加工方法、風(fēng)味物質(zhì)的萃取方法等。

若以萜烯指數(shù)評(píng)判紅茶的香氣品質(zhì)和特征，宜紅、利川紅的萜烯指數(shù)分別為0.954、0.917，二者香氣品質(zhì)特征顯著相關(guān)，而滇紅為0.773，與利川紅香氣品質(zhì)特征差異較大；熱圖分析結(jié)果與此一致。

分別對(duì)3 種紅茶中所有風(fēng)味物質(zhì)和9 種風(fēng)味物質(zhì)分析進(jìn)行PLS-DA顯示，以紅茶中9 種風(fēng)味物質(zhì)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，不僅可以進(jìn)行紅茶風(fēng)味類(lèi)型預(yù)測(cè)，而且其預(yù)測(cè)能力要優(yōu)于基于全部風(fēng)味物質(zhì)。此外VIP分析也發(fā)現(xiàn)，芳樟醇、順式芳樟醇氧化物、香葉醇、2-己烯醛對(duì)3 種紅茶風(fēng)味影響最大，這幾種風(fēng)味成分可作為3 種紅茶相互區(qū)分的主要特征標(biāo)志物。