張 明，羅 強(qiáng)，魏 婕，劉 巧，羅 璠

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

屎腸球菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的常見菌種，也是發(fā)酵食品中的正常菌種，在飼料、醫(yī)藥和食品中發(fā)揮著重要作用。屎腸球菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄（2013）》中的益生菌之一，能提高畜禽的生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[1]，降低糞便中病原微生物的數(shù)量[2-3]；屎腸球菌也用于調(diào)節(jié)人的腸道菌群，治療因腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉[4]。屎腸球菌在發(fā)酵食品中得到了廣泛應(yīng)用： Moreno等[5]將屎腸球菌DPC 1146作為發(fā)酵劑添加到切達(dá)干酪中，提高了干酪成熟過程中的穩(wěn)定性；Pingitore等[6]將屎腸球菌添加到新鮮米納斯奶酪中，延長(zhǎng)了奶酪的保質(zhì)期。

腸球菌素是腸球菌核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的蛋白質(zhì)類物質(zhì)的統(tǒng)稱，1975年，Kramer等[7]首次報(bào)道了屎腸球菌E1可以產(chǎn)生細(xì)菌素enterocin E1，到目前為止已經(jīng)報(bào)道了很多產(chǎn)細(xì)菌素的屎腸球菌[8-9]。屎腸球菌素應(yīng)用最廣泛的主要有enterocin A和enterocin B[10]，屬于II類細(xì)菌素，這類細(xì)菌素為小分子多肽或蛋白質(zhì)，具有良好的熱穩(wěn)定性和廣譜抑菌性，對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌具有很強(qiáng)的抑制作用。屎腸球菌素常被用于肉制品和乳制品防腐。Chakchouk-Mtibaa等[11]的研究表明，在4 ℃保存的火雞肉樣品中添加屎腸球菌素BacFL 31，可以延長(zhǎng)火雞肉保質(zhì)期并增強(qiáng)感官屬性。Vandera等[12]研究表明，將屎腸球菌KE82添加到牛奶中可以產(chǎn)生enterocin A和enterocin B，抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了牛奶的保質(zhì)期。

益生菌商業(yè)化的關(guān)鍵因素之一是其能否長(zhǎng)期維持遺傳穩(wěn)定。近幾年對(duì)于益生菌的遺傳穩(wěn)定性有相關(guān)研究，Min等[13]針對(duì)基因組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌在連續(xù)傳代過程中整個(gè)基因組序列保持高度的遺傳穩(wěn)定性；孔亞楠[14]對(duì)1 株植物乳桿菌進(jìn)行了4 000 代連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)菌株在連續(xù)傳代過程中，細(xì)胞形態(tài)、碳水化合物代謝能力、對(duì)腸胃液和膽鹽的耐受性及自凝集能力保持高度的遺傳穩(wěn)定性。但是關(guān)于細(xì)菌素遺傳穩(wěn)定性的研究鮮有報(bào)道。本研究擬從四川紅原地區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣中，篩選高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的乳酸菌。通過對(duì)菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性及抑菌特性的研究，篩選遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，以期為后期工業(yè)開發(fā)提供備選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品8 份，均采自四川阿壩州紅原縣。

1.1.2 指示菌

大腸桿菌ATCC 8099、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、禾谷鐮刀霉菌、鞘氨醇單胞菌、海氏腸球菌、耐久腸球菌，以上非標(biāo)準(zhǔn)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶德國(guó)Biofroxx公司；乳酸鏈球菌素 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST16R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特設(shè)備有限公司；ETC811基因擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng) 中國(guó)天能公司；Vortex-BE1旋渦混合器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；UV1900紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器公司；ELX-800酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；R40-IIB2超凈工作臺(tái) 中國(guó)青島海爾有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取1 mL酸奶于10 mL滅菌的EP管中，采用10 倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，選取100 μL 10-3～10-5稀釋度的樣品涂布于滅菌的改良MC培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h。挑取產(chǎn)生鈣溶圈的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基中反復(fù)劃線培養(yǎng)直至單菌落，將分離得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和觸酶實(shí)驗(yàn)，革蘭氏陽性且觸酶陰性的菌株作為后續(xù)篩選的出發(fā)菌株，保藏備用。

1.3.2 發(fā)酵上清液制備

將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液于6 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將上清液pH值調(diào)至6.0，用0.22 μm無菌濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

1.3.3.1 96 孔板初篩

以標(biāo)準(zhǔn)菌株為指示菌，采用96 孔板法測(cè)定菌株發(fā)酵液的抑菌效果[15]。取15 μL指示菌菌懸液（108CFU/mL）和185 μL菌株發(fā)酵上清液，置于無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm值，以等量指示菌接種于空MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，按下式計(jì)算抑菌率。抑菌率達(dá)到50%及以上的菌株進(jìn)一步復(fù)篩。

式中：OD1表示指示菌在乳酸菌發(fā)酵上清液中培養(yǎng)12 h后的OD600nm值；OD2表示指示菌在空白MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后的OD600nm值。

1.3.3.2 平板打孔法復(fù)篩

采用平板打孔法測(cè)定抑菌活性[16]：用1.5%的素瓊脂10 mL鋪底層，晾干后上面均勻放置牛津杯，將含108CFU/mL的指示菌菌液100 μL加入到10 mL的LB培養(yǎng)基中，混勻后倒入平板，晾干后取出牛津杯，每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL的發(fā)酵上清液，冰箱中放置2 h擴(kuò)散，37 ℃靜置培養(yǎng)5～12 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。以乳酸鏈球菌素作為陽性對(duì)照，以無菌水為陰性對(duì)照，以大腸桿菌ATCC 8099和金黃色葡萄球菌作為指示菌（后續(xù)的平板抑菌實(shí)驗(yàn)，未特殊說明的均以此設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和指示菌）。

1.3.4 H2O2排除

將過氧化氫酶溶解并按照終質(zhì)量濃度為1 mg/mL添加到菌株發(fā)酵上清液中，37 ℃水浴2 h后沸水浴煮沸5 min使酶滅活，用平板打孔法測(cè)定其抑菌活性[17]。

1.3.5 形態(tài)觀察與生理生化鑒定

對(duì)SC-Y12進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)。將菌株在MRS固體培養(yǎng)基30℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。美蘭牛奶生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、溶明膠實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.3.6 基因同源性分析

1.3.6.1 16S rDNA序列同源性分析

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因片段。16S rDNA引物序列[20]：上游引物Eu27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。PCR擴(kuò)增體系：采用25 μL體系，DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2×TaqMaster Mix預(yù)混酶12.5 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30 次，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

凝膠電泳檢驗(yàn)合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果拼接后在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì)，選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性達(dá)99%以上的部分序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.6.2rpoA序列同源性分析

以菌株的DNA基因組為模板，將其管家基因RNA聚合酶α亞基基因進(jìn)行擴(kuò)增。rpoA引物序列[21]：上游引物rpoA-21-F：5’-ATGATYGARTTTGAAAAACC-3’；下游引物rpoA-23-R：5’-ACHGTRTTRATDCCDGCRCG-3’。PCR擴(kuò)增體系：采用25 μL體系，DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，2×TaqMaster Mix預(yù)混酶12.5 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，3 次循環(huán)（95 ℃變性60 s，46 ℃退火135 s，72 ℃延伸75 s），30 次循環(huán)（95 ℃變性35 s，46 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物合格后將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。序列與GenBank中已知菌株的rpoA基因序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)16S rDNA及ropA序列同源性分析對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.7 抑菌活性與生長(zhǎng)量測(cè)定

將菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每2 h取樣一次，測(cè)定OD600nm，采用96 孔板法測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性，繪制菌株抑菌活性曲線和生長(zhǎng)曲線。

1.3.8 遺傳穩(wěn)定性分析

將菌株以1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代，取每個(gè)傳代周期第16小時(shí)的發(fā)酵液制備發(fā)酵上清液，用96 孔板法測(cè)定其抑菌活性，檢測(cè)該菌株在傳代過程中抑菌性能的穩(wěn)定性。

1.3.9 抑菌物質(zhì)特性分析

1.3.9.1 pH值敏感性

將菌株的發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)到pH 3.0、5.0、6.0、7.0、9.0，室溫放置30 min，再將pH值回調(diào)到pH 6.0，用平板打孔法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，以pH 6.0的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.3.9.2 蛋白酶的敏感性

將菌株的發(fā)酵上清液分別用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K在酶最適的作用條件下溫浴處理30 min，冷卻至室溫，將pH值調(diào)節(jié)到6.0，平板打孔法測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌活性，以未加蛋白酶處理的發(fā)酵上清液（pH 6.0）作為對(duì)照。

1.3.9.3 熱穩(wěn)定性

將菌株的發(fā)酵上清液分別在60、80、100 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫，采用平板打孔法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，以室溫條件下處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.3.10 抑菌譜的測(cè)定

采用平板打孔法測(cè)定發(fā)酵上清液對(duì)各種指示菌的抑菌效果，保證指示菌細(xì)菌的終濃度為106CFU/mL，霉菌的終濃度為104CFU/mL[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

通過革蘭氏染色、觸酶實(shí)驗(yàn)以及改良MC培養(yǎng)基鈣溶圈篩選，從8 份樣品中共分離得到308 株供試菌株。通過菌種的初篩和復(fù)篩，最后選取1 株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯穩(wěn)定抑菌效果的菌株（圖1），編號(hào)為SC-Y112，作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

圖 1 平板抑菌結(jié)果Fig. 1 Results of antibacterial tests on agar plates

2.2 H2O2排除

通過H2O2排除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用過氧化氫酶排除H2O2后菌株的抑菌能力幾乎沒有變化（P＞0.05），結(jié)果如表1所示，說明發(fā)酵上清液的抑菌效果不是由于H2O2造成的。

表 1 H2O2對(duì)菌株抑菌性能的影響Table 1 Effect of H2O2 on the antibacterial properties of the strain

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)

菌株在MRS固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)形成的菌落直徑為0.2～0.3 mm，表面光滑，質(zhì)地均勻，乳白色。菌株在美蘭牛奶中培養(yǎng)48 h，美蘭牛奶褪色，糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表 2 生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of the strain

2.3.2 16S rDNA序列同源性分析

通過16S rDNA基因序列測(cè)定（NCBI序列號(hào)為MT032338）及同源性分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與腸球菌屬的同源性均高達(dá)99%以上。16S rDNA序列鑒定能確定該菌株是腸球菌屬，但不能確定該菌株的種水平，因此采用管家基因進(jìn)一步鑒定。

2.3.3rpoA序列同源性分析

圖 2 SC-Y112的ropA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain SC-Y112 based on ropA gene sequence

將菌株的rpoA基因測(cè)序并進(jìn)行序列同源性分析，進(jìn)一步構(gòu)建了菌種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示。該菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚為一類。結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果、16S rDNA基因以及rpoA基因序列分析，判定該菌株為屎腸球菌。

2.4 抑菌活性與生長(zhǎng)量測(cè)定結(jié)果

細(xì)菌素的產(chǎn)生與其菌株生長(zhǎng)具有一定的關(guān)聯(lián)，研究表明細(xì)菌素的產(chǎn)生一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[23-24]。菌株SC-Y112的生長(zhǎng)和細(xì)菌素代謝曲線如圖3所示，菌株在接種后4 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較為一致，均是在接種后6 h開始分泌抑菌活性物質(zhì)，在12 h抑菌活性達(dá)到較高值并保持穩(wěn)定，20 h后抑菌活性開始下降。這可能是由于在酸性條件下抑菌物質(zhì)能吸被產(chǎn)生菌細(xì)胞表面吸附[25]，或者抑菌物質(zhì)被胞外蛋白酶水解，從而引起了發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)濃度下降。

圖 3 菌株生長(zhǎng)量與抑菌活性的關(guān)系Fig. 3 Relationship between SC-Y112 growth and its antibacterial activity

2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

通過生長(zhǎng)曲線測(cè)定，發(fā)現(xiàn)SC-Y112以16 h為一個(gè)傳代周期，在每個(gè)傳代周期內(nèi)，菌體數(shù)量以接近指數(shù)形式（2n）增殖，即一個(gè)傳代周期內(nèi)的生長(zhǎng)代數(shù)（細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù)）為log2100≈6.64 代[26]。將菌株連續(xù)傳代至110 代，檢測(cè)每個(gè)世代的菌株發(fā)酵上清液（16 h）的抑菌活性，結(jié)果如表3所示。在13～80 代之間抑菌活性保持穩(wěn)定，在86 代以后抑菌活性有明顯下降（P＜0.05），但仍保持約80%抑菌活性。白梅[26]的研究證明干酪乳桿菌（Lactobacillus caseiZhang）在2 000 代的傳代中其表型特征，對(duì)胃液、腸液、膽汁的耐受性均保持穩(wěn)定，基因組突變率也較低，說明有良好的穩(wěn)定性。劉衍芬[27]研究嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，在連續(xù)傳代至約85 代時(shí)表型特征、發(fā)酵性能、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、全蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）均無顯著變化；但在傳代至約113 代時(shí)，嗜熱乳桿菌的全細(xì)胞蛋白質(zhì)電泳圖譜顯示有一些高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)不再表達(dá)，保加利亞乳桿菌RAPD和全蛋白質(zhì)SDS-PAGE均有變化。本研究表明抑菌物質(zhì)在86 代以后出現(xiàn)明顯下降，可能是由菌種衰退造成，具體原因有待進(jìn)一步分析。

2.6 抑菌物質(zhì)特性分析

2.6.1 pH值穩(wěn)定性

如表4所示，發(fā)酵上清液在pH 9.0條件下處理后，不顯示抑菌活性，在pH 3.0～7.0范圍內(nèi)處理后仍表現(xiàn)抑菌活性，但隨著pH值的上升抑菌活性明顯下降（P＜0.05），說明該菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)在酸性條件下較穩(wěn)定，而在堿性條件下不穩(wěn)定，該結(jié)果與前期很多研究結(jié)果相似[28-30]。

表 4 不同pH值處理發(fā)酵上清液的抑菌活性Table 4 Diameters of inhibition zones of the fermentation supernatant under different pH conditions

2.6.2 酶的敏感性

表 5 不同蛋白酶處理發(fā)酵上清液的抑菌活性Table 5 Diameters of inhibition zones of the fermentation supernatant after being treated with diffeent proteases

如表5所示，SC-Y112的發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶K處理后抑菌效果完全消失，可以初步判斷SC-Y112所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)性質(zhì)。而SC-Y112的抑菌物質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)酸性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感性，與多數(shù)研究結(jié)果[31]一致，結(jié)合pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)推測(cè)SC-Y112產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能在堿性條件下不穩(wěn)定，因而出現(xiàn)堿性酶處理后活性消失，也可能是被胰蛋白酶水解而造成的活性消失；而該種物質(zhì)能夠被酸性蛋白酶類水解從而失去活性。該抑菌物質(zhì)表現(xiàn)出對(duì)中性蛋白酶作用不敏感，該特性與尚楠等[32]報(bào)道的1 株雙歧桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的性質(zhì)相似。

2.6.3 熱穩(wěn)定性

表 6 高溫處理發(fā)酵上清液的抑菌活性Table 6Diameters of inhibition zones of the high temperature-treated fermentation supernatant

如表6所示，SC-Y112發(fā)酵上清液在高溫處理后仍具有抑菌效果，在100 ℃處理30 min后對(duì)指示菌仍具有約87%的抑菌效果，溫度對(duì)SC-Y112發(fā)酵上清液的抑菌效果影響不顯著（P＞0.05），說明SC-Y112發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)有較好的耐熱性。大量研究也證明了細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性[33-34]，能在100 ℃甚至121 ℃條件下仍保持穩(wěn)定。

2.7 抑菌譜測(cè)定結(jié)果

表 7 屎腸球菌發(fā)酵上清液的抑菌譜Table 7 Antibacterial spectrum of the fermentation supernatant of E. faecium

由表7可見，抑菌譜實(shí)驗(yàn)表明，SC-Y112產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有一定的廣譜抑菌性，對(duì)部分革蘭氏陽性指示菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌）和革蘭氏陰性指示菌（大腸桿菌、沙門氏菌、鞘氨醇單胞菌）均具有較好的抑菌效果，其中對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌的抑菌效果最好，對(duì)霉菌沒有抑制效果。屎腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素普遍能抑制革蘭氏陽性菌，尤其是單核細(xì)胞性李斯特菌，對(duì)金黃色葡萄球菌也有抑制效果[35]。而對(duì)革蘭氏陰性菌株和真菌的抑菌效果，則表現(xiàn)出差異，屎腸球菌TJUQ1[36]所產(chǎn)細(xì)菌素不僅能抑制大腸桿菌和沙門氏菌，而且還能抑制魯氏酵母；屎腸球菌ZJ19[37]能抑制革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和沙門氏菌）；而屎腸球菌AS 1.2025[38]、屎腸球菌M-2[39]所產(chǎn)細(xì)菌素不抑制大腸桿菌。另外，本研究中菌株SC-Y112產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）的抑菌效果接近，這與許多研究結(jié)果[40]有所差異，造成這種差異的原因目前鮮見相關(guān)的殺菌機(jī)理的深入研究報(bào)道，需進(jìn)一步探索。SC-Y112產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)乳酸桿菌（植物乳桿菌和短乳桿菌）沒有抑制效果，這種抑菌特性與多數(shù)研究報(bào)道有差異[41]，這也是其在食品領(lǐng)域可能具有更好的應(yīng)用效果。同時(shí)，SC-Y112對(duì)親緣關(guān)系更近的腸球菌（海氏腸球菌和耐久腸球菌）有抑制效果，相似的抑菌特性在許多研究中均有報(bào)道[42]，這種抑菌特性為多數(shù)細(xì)菌素所共有。

3 結(jié) 論

屎腸球菌是乳酸菌中腸球菌屬重要菌種，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸、醇和細(xì)菌素，具有高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。大量研究表明屎腸球菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素，從而在食品及飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用。本研究從川西北阿壩地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離篩選出1 株具有較高抑菌活性的菌株SC-Y112，經(jīng)過16S rDNA和rpoA序列同源性分析，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定為屎腸球菌。經(jīng)過排酸及排除H2O2后，發(fā)酵上清液仍具有明顯抑菌特性，采用不同蛋白酶處理后，抑菌物質(zhì)的抑菌活性出現(xiàn)下降或消失，確定該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)含有蛋白質(zhì)成分，由于該物質(zhì)具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，初步推測(cè)其是一種小肽。通過菌株連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)，證明該菌株在110 代內(nèi)能保持較好的抑菌性，說明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，該抑菌物質(zhì)在pH 3.0～7.0的條件下有較好的抑菌性，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定抑菌效果。該菌株抑菌效果明顯，遺傳特性穩(wěn)定，有望成為商業(yè)開發(fā)的備選菌株。