陳麗花，任麗霞，李東娜，馬 霞

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

米酒是中國傳統(tǒng)的非蒸餾低乙醇含量飲料，由糯米或大米糊化后接種甜酒曲發(fā)酵制成[1]，由于口感醇厚、營養(yǎng)豐富而廣受歡迎[2]?！扒司浦恰保魄员环Q為酒釀造的靈魂，是因為酒曲中含有起糖化、發(fā)酵作用的微生物及其產生的各種酶，其中酵母菌是酒曲中最重要的微生物之一，其發(fā)酵性能及代謝產物的差異直接影響到出酒率和酒的風味品質。酒曲中的酵母菌主要有兩大類，釀酒酵母和非釀酒酵母。釀酒酵母將糖類高效轉化為乙醇的同時產生風味物質[3]；非釀酒酵母又稱生香酵母，主要利用糖類、蛋白質、氨基酸等物質，生成大量甘油、酯類等物質，起到增香作用[4]?？傮w來說，優(yōu)質的酵母菌應滿足發(fā)酵初期增殖速度快、發(fā)酵產乙醇能力強、產生的揮發(fā)性香氣物質豐富、對高溫或高乙醇含量等環(huán)境耐受性好等特點。

傳統(tǒng)酒曲大多采取開放式培養(yǎng)，具有制作周期長、受氣候及溫度影響大、品質不穩(wěn)定且存在一定的雜菌污染隱患等缺陷，因此目前越來越多研究者開始關注優(yōu)良發(fā)酵性能酵母菌種資源的開發(fā)利用[5-7]。將優(yōu)質酵母菌種直接應用于釀酒生產更為安全、高效[8]，且更有利于提高酒的品質[9]。酒的品質和典型性與揮發(fā)性香氣物質密切相關。頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用技術具有分離高效、定性準確、靈敏度高等優(yōu)點[10-11]，已成為研究香氣成分的有效手段并被廣泛應用[12-14]。本研究從中國幾種特色地方甜酒曲中分離出具有優(yōu)質發(fā)酵性能的酵母并進行鑒定，探討其發(fā)酵和產香特征，以期為提升米酒品質、實現(xiàn)產業(yè)化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜酒曲樣品分別由上海崇明、浙江寧波和湖北宜昌等地釀酒企業(yè)提供；甜酒曲（米粉、根霉菌） 安琪酵母股份有限公司；糯米 上海致富釀造有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限責任公司；米曲汁液體培養(yǎng)基參照文獻[15]制備；dNTP、TaKaRa LATaqTM聚合酶 寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；NaCl（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ABI-2720型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、SPME手動進樣手柄 美國Supelco公司；7890B/5977B型GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 甜酒曲中酵母菌的分離純化

在90 mL無菌生理鹽水中加入10 g甜酒曲，180 r/min振蕩搖勻30 min，制備酵母菌懸浮液，采用梯度稀釋和平板涂布相結合的方法分離純化酵母菌[16]。

1.3.2 26S rDNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

使用快速DNA提取試劑盒從樣品中提取酵母菌DNA，以引物26S-F（5’- GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’）和26 S-R（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）擴增26S rDNA的D1/D2區(qū)。PCR擴增體系：dd H2O 39 μL，10 μmol/L 26 S-F引物和26 S-R引物各1.5 μL， dNTP（10 mmol/L）1.0 μL，5 U/μLTaq聚合酶1.0 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，20 ng/μL基因組DNA模板1.0 μL，總體積50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。PCR產物的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

使用BLAST將26S rDNA測序結果在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上比對，根據(jù)同源性搜索結果，使用MEGA 6.0軟件對序列進行分析，采用Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.3.3 酵母菌性能分析

分別將酵母菌種子液以1%的接種量接種至不同乙醇體積分數(shù)（4%、6%、8%、10%、12%、14%），不同溫度（30、36、42、48、54 ℃），不同pH值（3、5、7、9、11）的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2 d后在600 nm波長處測培養(yǎng)液OD值，考察酵母對乙醇、溫度和pH值的耐受性[18]。

發(fā)酵力采用CO2失重法[19]測定，產酯量采用皂化滴定法[15]測定。

1.3.4 酵母菌產香分析

將酵母分別按照106CFU/mL接入米曲汁，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d，發(fā)酵液過濾澄清后于4 ℃保存?zhèn)溆谩⒑?.5 g NaCl和4 mL發(fā)酵液的頂空瓶在45 ℃水浴中平衡15 min，老化后的萃取頭在45 ℃吸附40 min插入進樣口進行GC-MS分析[20]。

色譜條件：毛細管色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×250 μm，0.25 μm）；手動進樣，進樣口溫度250 ℃；程序升溫：40 ℃，保留5 min，以6 ℃/min速率升至120 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min速率升至240 ℃，保留15 min；檢測器溫度250 ℃；以He為載氣，恒流量1 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：電子電離源，電子能量70 eV；掃描范圍10～500 u；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃。將全離子掃描質譜圖通過NIST 11文庫進行對比分析，并對匹配度大于80（最大值為100）的香氣化合物通過峰面積歸一化方法進行定量[21]。

1.3.5 酵母菌發(fā)酵液的香氣感官評定

采用定量描述分析（quantitaive descriptive analysis，QDA）法評價酵母菌發(fā)酵液的香氣特征類型。感官品評小組由10 位訓練有素的品評師（5 男5 女，年齡為23～40 歲）組成，實驗在食品感官實驗室內進行，樣品隨機呈現(xiàn)。香氣特征描述詞的開發(fā)和確定參照文獻[22]，最終確定為果香、花香、酒香、脂肪香、草香、堅果香和整體香氣，強度分為10 檔，0～9分別為氣味從無到較弱、中等、較強和極強。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有分析均為3 次平行實驗的結果；采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 酵母的遺傳鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

從3 種地方特色甜酒曲中經過多次分離純化共得到12 株酵母菌，采用杜氏管和嗅聞法分別考察其發(fā)酵力和產香能力，得到6 株具有優(yōu)質產香能力的酵母菌株，分別命名為CMY001、CMY002、CMY003、NBY002、NBY003和YCY001。

核糖體DNA中的26S rDNA D1/D2區(qū)具有較高的突變率，可作為親緣關系密切菌株之間的分類研究[23]。對篩選到的6 株酵母菌進行26S rDNA鑒定，在NCBI中用BLAST比較測序結果并采用Neighbor-Joining法構建6 株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。經過比對分析發(fā)現(xiàn)菌株CMY001、CMY003和NBY003為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），另外3 株為非釀酒酵母，其中菌株CMY002和NBY002為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株YCY001為光滑假絲酵母（Candida glabrata）。

圖 1 酵母菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic tree constructed for yeast strains using Neighbor-Joining analysis based on the 26S rDNA sequence

2.2 酵母的耐受性分析

2.2.1 對乙醇的耐受性

圖 2 酵母菌株在不同乙醇體積分數(shù)下的耐受性Fig. 2 Tolerance of yeast strains to different alcohol levels

酵母的乙醇耐受性主要與細胞壁、細胞膜的結構有關，乙醇體積分數(shù)較高會對酵母有毒害作用[24-25]，導致發(fā)酵緩慢甚至中止，因此良好的乙醇耐受性是保證酵母菌發(fā)酵順利進行的前提條件[26]。如圖2所示，在乙醇體積分數(shù)為4%～14%范圍內，6 株酵母均能夠生長，但隨著乙醇體積分數(shù)的增加其生長能力逐漸減弱。YCY001在小于10%的乙醇體積分數(shù)下耐受性良好，CMY002在大于10%的乙醇體積分數(shù)下耐受性較強。當乙醇體積分數(shù)超過12%后，所有酵母菌株的活力均受到抑制。

2.2.2 對溫度的耐受性

酵母菌最適生長溫度一般為28 ℃左右，發(fā)酵過程中會釋放熱量而導致體系溫度升高，因此需要考察酵母對溫度的耐受性。如圖3可知，隨著溫度的提升，酵母菌株的活力逐漸減弱。相對而言，NBY002對高溫的耐受性最好，其次是CMY001和CMY002。6 株酵母菌在超過48 ℃時，活力均受到極大抑制。

圖 3 酵母菌株在不同溫度下的耐受性Fig. 3 Tolerances of yeast strains to different temperatures

2.2.3 對pH值的耐受性

圖 4 酵母菌株在不同pH值下的耐受性Fig. 4 Tolerances of yeast strains to different pH values

酵母菌最適生長pH值通常為4～5，發(fā)酵過程中產生的酸性物質會導致體系酸度的變化。由圖4可以看出，酵母菌株在pH 3～11之間均能生長繁殖，pH 5～7范圍內均生長良好，在其中NBY003、CMY001、CMY002、YCY001的最適生長pH值為5，而NBY002和CMY003的最適生長pH值為7。釀酒發(fā)酵體系的pH值一般都偏酸性，因此所篩選到的酵母菌株均可在釀酒體系中良好生長。

2.3 酵母菌的發(fā)酵力及產酯力分析

2.3.1 發(fā)酵力分析

圖 5 酵母菌株的發(fā)酵力Fig. 5 Fermentation ability of yeast strains

酵母發(fā)酵產生的乙醇含量與CO2含量有一定正相關關系，繁殖快、發(fā)酵能力強的酵母菌能較早地達到主發(fā)酵階段，從而形成生長優(yōu)勢并有效抑制其他不利于發(fā)酵的雜菌，初步保證釀酒質量[27]。由圖5可知，各酵母菌株的總CO2質量損失趨勢一致，且在24～36 h內的質量損失率較高，NBY003的CO2質量損失最大，其次是CMY001和YCY001，說明這3 種酵母菌的發(fā)酵力較強。CMY002的發(fā)酵起步較晚，CO2質量損失在12～24 h之間變化不大，但在24～48 h表現(xiàn)較好。CMY003和NBY002的CO2質量損失變化不大，發(fā)酵能力較弱。

2.3.2 產酯力分析

產酯能力強的酵母可對米酒的感官品質起到修飾、提高作用。如圖6所示，在相同發(fā)酵條件下各酵母菌株的產酯能力差異較大。王鵬昊等[28]從小曲中篩選到1 株產酯量為2.684 g/L的異常威克漢姆酵母，本研究篩選到的NBY002和CMY003產酯量分別高達5.125 g/L和4.576 g/L。

圖 6 酵母菌株的產酯力Fig. 6 Ester production capacities of yeast strains

2.4 酵母菌發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣物質分析

2.4.1 不同酵母菌發(fā)酵液揮發(fā)性香氣物質種類及相對含量對比分析

通過SPME-GC-MS得到6 株酵母菌發(fā)酵產生的揮發(fā)性香氣物質如圖7所示。6 株酵母菌發(fā)酵液中共檢測到揮發(fā)性香氣物質87 種，各酵母發(fā)酵液的揮發(fā)性成分之間有顯著差異，共有的揮發(fā)性香氣物質有苯甲醇、β-苯乙醇、苯甲酸、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、丙烯酸辛酯、仲辛酮、2-壬酮、苯酚、2,4-二叔丁基苯酚和正十三烷，其中β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和丙烯酸辛酯的相對含量均較高。

NBY002發(fā)酵液中共檢測到47 種化合物，包括醇類7 種、酸類4 種、酯類13 種、醛類4 種、酮類3 種、芳香類7 種、烴類6 種及其他化合物3 種，其中主要香氣成分（相對含量≥2%）為異戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和丙烯酸辛酯。NBY003發(fā)酵液中共檢測到42 種化合物，包括醇類7 種、酸類6 種、酯類13 種、醛類4 種、酮類2 種、芳香類6 種、烴類4 種，其中主要香氣成分為β-苯乙醇、辛酸、乙酸苯乙酯、甲酸異戊酯、丙烯酸辛酯和仲辛酮。YCY001發(fā)酵液共鑒定出49 種化合物，包括醇類5 種、酸類5 種、酯類22 種、醛類4 種、酮類2 種、芳香類4 種、烴類4 種及其他化合物3 種，其中主要香氣成分為β-苯乙醇、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、甲酸異戊酯、丙烯酸辛酯、苯乙醛和2,4-二叔丁基苯酚。

圖 7 揮發(fā)性香氣化合物的相對含量熱圖Fig. 7 Heat map of relative contents of volatile flavor compounds

該菌株產生的風味物質種類尤其是酯類物質最多，說明菌株YCY001在米酒中具有較好的應用潛力。CMY001發(fā)酵液中共鑒定出41 種化合物，包括醇類7 種、酸類5 種、酯類13 種、醛類3 種、酮類2 種、芳香類6 種、烴類3 種及其他化合物2 種，其中主要香氣成分為β-苯乙醇、正己酸、辛酸、正癸酸、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丙烯酸辛酯和2,4-二叔丁基苯酚。CMY002發(fā)酵液中共檢測到43 種化合物，包括醇類8 種、酸類6 種、酯類11 種、醛類2 種、酮類2 種、芳香類7 種、烴類4 種及其他化合物3 種，其中主要香氣成分為正戊醇、β-苯乙醇、辛酸、正癸酸、丙烯酸辛酯和仲辛酮。CMY003發(fā)酵液共鑒定出37 種化合物，包括醇類8 種、酸類6 種、酯類10 種、酮類2 種、芳香類6 種、烴類4 種及其他化合物1 種，其中主要香氣成分為正戊醇、β-苯乙醇、辛酸、乙酸苯乙酯、丙烯酸辛酯和仲辛酮。正戊醇、異戊醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、甲酸異戊酯、丙烯酸辛酯、苯乙醛和仲辛酮具有果香，β-苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯和2,4-二叔丁基苯酚具有花香[29]，這些物質會提升米酒香氣；正己酸、辛酸和正癸酸有酸乳、脂肪味和汗味，這些物質的較高含量可能會導致米酒風味變差。

米酒中的醇類物質是主要呈香物質，主要來源于發(fā)酵、氨基酸轉化和亞麻酸降解物的氧化[4]。酯類是米酒中最豐富的揮發(fā)性香氣成分，由發(fā)酵過程中酸和醇的酯化作用形成，也是特殊花果香氣的重要基礎[30-31]。酸類是影響米酒香氣的重要因素之一，但是當濃度過高時，可能會產生不良影響，其含量應控制在適當?shù)臐舛确秶鷥萚4]。此外，酮類通常是不飽和脂肪酸氧化而成，醛類香氣閾值一般較低，它們都是影響米酒風味的重要因素[32]。

圖 8 不同酵母所產不同類型揮發(fā)性香氣物質的相對含量Fig. 8 Relative contents of different types of volatile flavor compounds produced by different yeast strains

如圖7、8所示，由于不同酵母菌代謝途徑的差異使其發(fā)酵產生的香氣物質種類及相對含量不同。6 株酵母菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣物質中酯類的種類最多且相對含量最高，其中光滑假絲酵母YCY001發(fā)酵液中酯類相對含量顯著高于其他菌株，Sujaya等[33]發(fā)現(xiàn)光滑假絲酵母是巴厘傳統(tǒng)米酒brem中的主要酵母菌，Peter等[34]發(fā)現(xiàn)光滑假絲酵母與庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzeviion）共培養(yǎng)時可顯著提升葡萄酒的香氣。CMY002發(fā)酵液中除含有豐富的酯類物質外，呈現(xiàn)水果香氣的正戊醇、仲辛酮相對含量也較高。NBY002發(fā)酵液中醇類物質相對含量顯著高于其他菌株，其中β-苯乙醇相對含量較高。β-苯乙醇是所有樣品中都大量含有的主要香氣物質且嗅覺閾值較低，具有清甜的玫瑰花香，其在米酒中的相對含量差異會直接影響米酒的品質[35]。CMY002和NBY002是異常威克漢姆酵母，由于其糖苷水解酶活性有助于生成發(fā)酵液的香氣成分[36]。Izquierdo Ca?as等[37]研究發(fā)現(xiàn)同一條件下接種異常威克漢姆酵母比不接種發(fā)酵的葡萄酒酯類濃度更高，產生的果香味揮發(fā)性化合物更多，有機酸濃度更低。

2.4.2 不同酵母菌發(fā)酵液呈香差異分析

QDA法是一種綜合性的感官評定方法，既能描述樣品感官特征，又能清晰展現(xiàn)樣品間差異[22]。不同酵母菌發(fā)酵米曲汁的香氣特征感官評價結果如圖9所示，可知不同酵母菌的呈香特征有明顯差異。菌株CMY002和CMY003發(fā)酵液的果香特征最明顯，與GC-MS分析結果中酯類和醇類物質的相對含量高對應；YCY001發(fā)酵液的花香和堅果香最濃郁，與GC-MS分析結果中β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和醛類的相對含量高對應；CMY001發(fā)酵液的脂肪香、草香、酒香評價最高，與GC-MS分析結果中高級醇和正己酸、辛酸、正癸酸等酸類化合物相對含量高對應。6 種酵母發(fā)酵的米曲汁中，整體香氣評價最高的是YCY001，其次是NBY002。

圖 9 不同酵母菌發(fā)酵液的香氣評價圖Fig. 9 Evaluation of aroma profiles produce by different yeast strains

2.4.3 不同酵母菌發(fā)酵液香氣化合物主成分分析（principal components analysis，PCA）

PCA可以將多維變量簡化為盡可能少的變量，且新變量可以盡可能保持原有的信息，是一種化繁為簡的統(tǒng)計分析方法[38]。為進一步了解6 種酵母菌發(fā)酵液的香氣成分和呈香差異，采用PCA模型對不同酵母菌發(fā)酵液的香氣化合物進行相關性分析，結果如圖10所示。PC1的貢獻率為80.62%，PC2的貢獻率為9.76%，2 個PC的累計貢獻率達90.38%，可以很好地反映6 個樣品中揮發(fā)性成分的全部信息。由圖10a可知，菌株YCY001發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣化合物與其他發(fā)酵液有顯著差異，而CMY002、CMY003和NBY003相對聚集，表明這3 株酵母發(fā)酵液中揮發(fā)性成分的組成差異相對較小。據(jù)圖10b可知，丙烯酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、甲酸異戊酯、β-苯乙醇、辛酸和苯甲酸乙酯是影響不同酵母菌發(fā)酵液風味差異的主要揮發(fā)性香氣物質。

圖 10 揮發(fā)性香氣化合物的PCA得分圖（a）和載荷圖（b）Fig. 10 PCA score plot (a) and PCA loading plot (b) of volatile flavor compounds produced by different yeast strains

3 結 論

本研究從甜酒曲中共分離出6 株優(yōu)質酵母菌，經26S rDNA鑒定發(fā)現(xiàn)CMY001、CMY003、NBY003為釀酒酵母，CMY002、NBY002為異常威克漢姆酵母，YCY001為光滑假絲酵母。YCY001在乙醇體積分數(shù)小于10%條件下耐受性良好，CMY002在乙醇體積分數(shù)大于10%條件下耐受性較強；NBY002對高溫的耐受性最好，其次是CMY001和CMY002；各菌株在pH值為3～11下均能生長。發(fā)酵力最強的是NBY003，其次是CMY001和YCY001；菌株NBY002和CMY003產酯量較高。SPMEGC-MS分析結果表明，6 株酵母產生的揮發(fā)性香氣物質主要為酯類，其中菌株YCY001發(fā)酵產物中酯類的種類和相對含量顯著高于其他菌株，NBY002產生的β-苯乙醇相對含量明顯高于其他菌株。從發(fā)酵液香氣成分的感官評價看，CMY002發(fā)酵液由于含有大量的酯類和醇類物質而呈現(xiàn)較強的果香；YCY001由于產生β-苯乙醇、乙酸苯乙酯和醛類等物質較多，發(fā)酵液具有較強的花香和堅果香；CMY001發(fā)酵液由于含有較多的高級醇和正己酸、辛酸、正癸酸等酸類化合物，呈現(xiàn)脂肪香、酒香和草香，而果香和花香較弱；YCY001發(fā)酵液的整體香氣評價最高。PCA得分圖表明菌株YCY001與其他菌株產香有顯著差異；PCA載荷圖表明，丙烯酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、甲酸異戊酯、β-苯乙醇、辛酸和苯甲酸乙酯是不同酵母呈現(xiàn)不同產香特征的關鍵物質。本研究結果可為提升中國傳統(tǒng)米酒的風味品質、不同菌種組合發(fā)酵以生產不同香氣特征的米酒及實現(xiàn)米酒的標準化生產提供一定的參考。