吳博華，蔣雪薇,2,*，張金玉，阮志強(qiáng)，梁勝男，陳永發(fā),2，周尚庭

（1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410600；3.加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410600）

醬油起源于中國，至今已有2 500多年的歷史[1]。醬油是以大豆和小麥為主要原料，經(jīng)過微生物及其酶系的長期作用，形成的具有特殊色澤、香氣、滋味和體態(tài)的液態(tài)調(diào)味液[2]。傳統(tǒng)醬油釀造是一個開放式的自然發(fā)酵過程，混合菌群的發(fā)酵體系賦予了醬油獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，但開放式發(fā)酵容易使醬油受到污染微生物的影響，質(zhì)量不穩(wěn)定，加之發(fā)酵周期長，從產(chǎn)量到品質(zhì)都難以適應(yīng)當(dāng)下醬油企業(yè)發(fā)展的要求。現(xiàn)代醬油發(fā)酵工藝采用封閉連續(xù)式制曲、人工添加風(fēng)味菌的罐式高鹽稀態(tài)發(fā)酵，制曲及發(fā)酵得到了有效的控制，有利于保證產(chǎn)品品質(zhì)[3]。醬油釀造的關(guān)鍵工藝——制曲和發(fā)酵均與微生物的代謝活動密切相關(guān)，其中制曲主要是米曲霉（Aspergillus oryzae）或醬油曲霉（A. sojae）的生長及產(chǎn)生降解蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)相關(guān)的蛋白酶、淀粉酶等，為后續(xù)發(fā)酵中產(chǎn)生糖類、多肽，氨基酸等醬油風(fēng)味物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[4]；醬醪發(fā)酵則是以魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）等酵母菌和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等乳酸菌為主體的混合菌群發(fā)酵體系，在稀醪狀態(tài)下代謝產(chǎn)生醇、酯、酸、酮、醛、酚和雜環(huán)類化合物等物質(zhì)，賦予醬油特殊的風(fēng)味[5]。

芽孢桿菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的微生物[6-7]，具有良好的耐受性和蛋白酶及淀粉酶分泌能力，在發(fā)酵中能促進(jìn)原料降解和提升發(fā)酵食品風(fēng)味[8-9]。有研究報道，高產(chǎn)谷氨酰胺酶的芽孢桿菌能提升醬油氨態(tài)氮的含量[10]；隨著對醬油發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)研究的深入，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌也是醬醪中的優(yōu)勢菌群，在發(fā)酵過程中發(fā)揮重要的作用[11-14]?？梢钥闯?，芽孢桿菌對醬油發(fā)酵的呈味增香具有比較關(guān)鍵的作用。鑒于芽孢桿菌的存在影響成品醬油的滅菌效果[15]，對醬醪中芽孢桿菌的研究一直不夠重視，隨著醬香型白酒中芽孢桿菌對醬香及功能因子貢獻(xiàn)的深入研究[16-17]，芽孢桿菌作為醬油釀造菌種的基因資源及種質(zhì)資源將逐漸受到關(guān)注。本研究從高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中分離、篩選、鑒定出3 株促進(jìn)醬醪發(fā)酵的芽孢桿菌，并將其應(yīng)用到醬醪的鹽鹵發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)有提升發(fā)酵醬油氨態(tài)氮、還原糖含量和吡嗪類物質(zhì)及其前體乙偶姻和2,3-丁二醇含量的作用，為芽孢桿菌在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪采自湖南某醬油廠；枯草芽孢桿菌（B. subtillis）CS1.03，分離自曬露法醬醪，由湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心（長沙理工大學(xué)分中心）保藏。

福林-酚 上海麥克林生化科技有限公司；L-酪氨酸上海博奧生物科技有限公司；剛果紅 北京化學(xué)試劑公司；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、酪蛋白、3,5-二硝基水楊酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

50 g/L鹽質(zhì)量濃度牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、瓊脂20 g/L、NaCl 50 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；50 g/L鹽質(zhì)量濃度酪素培養(yǎng)基：干酪素4 g/L于堿性條件下溶解后調(diào)節(jié)pH值至中性，115 ℃滅菌20 min后與50 g/L鹽質(zhì)量濃度牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混勻；50 g/L鹽質(zhì)量濃度淀粉培養(yǎng)基：取牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉50 g/L、可溶性淀粉2 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；50 g/L鹽質(zhì)量濃度CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉50 g/L、瓊脂20 g/L、pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；制曲培養(yǎng)基：蒸煮豆粕-炒麥-水以2∶1∶1質(zhì)量比混勻后裝瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

E200顯微成像系統(tǒng) 尼康儀器（上海）有限公司；UV1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；PE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VERITI梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ChampGel 5000 Plus凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國布魯克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱 瑞思泰康科技（北京）有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）針美國色譜科公司。

圖 1 促醬醪發(fā)酵芽孢桿菌的篩選流程Fig. 1 Flow chart of the screening process of Bacillus promoting moromi fermentation

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌篩選流程

芽孢桿菌篩選見圖1。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的初篩

稱取不同發(fā)酵時間（2、3、4 個月）的高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪樣品30 g，于無菌條件下加入到100 mL無菌水中，混勻，85 ℃水浴處理10 min，梯度稀釋后涂布于50 g/L鹽質(zhì)量濃度酪素培養(yǎng)基平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取水解圈與菌落直徑比（D/d值）較大的菌株進(jìn)一步分純獲得純培養(yǎng)菌株。

1.3.3 牛津杯法復(fù)篩高蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活性菌株

挑取純培養(yǎng)菌株接種至50 g/L鹽質(zhì)量濃度牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)24 h，收集菌體，制備成菌細(xì)胞數(shù)為108個/mL的菌懸液，取0.1 mL菌懸液接種到插在50 g/L鹽質(zhì)量濃度酪素培養(yǎng)基的牛津杯中[18]，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，測量水解圈直徑。挑取優(yōu)選得到的高蛋白酶活性菌株，按照酪素培養(yǎng)基所述方法接種到插在50 g/L鹽質(zhì)量濃度淀粉培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基的牛津杯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，將碘液噴灑在淀粉培養(yǎng)基上，測量淀粉水解圈直徑，將1 mg/mL剛果紅溶液噴灑在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，染色1 h后，用1 mol/L NaCl溶液洗滌1 h，測量纖維素水解圈直徑。

1.3.4 酶活性測定

取1 mL菌細(xì)胞數(shù)為108個/mL的芽孢桿菌菌懸液接種于制曲培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h取樣測定蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活性。

1.3.5 菌種鑒定

1.3.5.1 菌落及菌體形態(tài)鑒定

挑取少量菌落在50 g/L鹽質(zhì)量濃度牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡成像系統(tǒng)觀察形態(tài)并成像。

1.3.5.2 16S rRNA序列分析鑒定

提取所篩菌株的基因組DNA，并以此為模板，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物擴(kuò)增菌株16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板2 μL，上下游引物各2 μL，Taq聚合酶1 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，10×PCR Buffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)齊50 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)25 次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.6 制曲及鹽鹵發(fā)酵

將1 mL菌細(xì)胞數(shù)為108個/mL的芽孢桿菌菌懸液接種到發(fā)酵體系中制曲72 h后，按曲-鹽水質(zhì)量比為1∶2拌入16.7%的鹽水，置于37 ℃恒溫發(fā)酵，總計發(fā)酵時間為28 d，分別在發(fā)酵第0、7、14、21、28天取醬醪壓榨醬油。

1.3.7 酶活性測定

1.3.7.1 蛋白酶、淀粉酶活性測定

蛋白酶活性、淀粉酶活性參照GB 1886.174—2016《食品添加劑食品工業(yè)用酶制劑》[19]測定，蛋白酶活性以干質(zhì)量計，計算如下式：

式中：A為在680 nm波長處測得的吸光度；K為吸光常數(shù)，本實驗K=98.88；N為稀釋倍數(shù)，本實驗N=40；10為反應(yīng)時間/min；W為曲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，本實驗中W=60.98%。

淀粉酶活性以干質(zhì)量計，計算公式如下：

式中：c為測試酶樣濃度，查詢GB 1886.174—2016附錄B獲得；N為稀釋倍數(shù)，本實驗N=6。

1.3.7.2 纖維素酶活性測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法[20]，1 個纖維素酶活性單位（U）定義為1 g干質(zhì)量曲中纖維素酶在40 ℃、pH 4.8條件下，1 min分解CMC-Na產(chǎn)生葡萄糖的量/mg，纖維素酶活性以干質(zhì)量計，計算公式如下：

式中：A為待測樣品吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖質(zhì)量；N為稀釋倍數(shù)，本實驗N=2。

1.3.8 發(fā)酵醬油還原糖、總酸、氨態(tài)氮測定

還原糖含量測定參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[21]；總酸、氨態(tài)氮含量測定參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[22]。

1.3.9 發(fā)酵醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

樣品準(zhǔn)備：取發(fā)酵相應(yīng)時間的壓榨醬油，添加5 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)物，總體積為2 mL；SPME條件：振蕩器50 ℃，將醬油樣品加熱振蕩25 min；GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min，分流比為10∶1；MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。揮發(fā)性化合物定量計算公式如下：

式中：C1為揮發(fā)性化合物濃度；C2為內(nèi)標(biāo)物濃度；A1為揮發(fā)性化合物峰面積；A2為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 25軟件對水解圈直徑進(jìn)行差異顯著性分析，酶活性測定重復(fù)3 次，對醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)類別進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 促醬醪發(fā)酵芽孢桿菌篩選

醬油是以豆粕和小麥為原料經(jīng)微生物發(fā)酵釀造而成的傳統(tǒng)調(diào)味品，蛋白酶通過水解原料中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，形成醬油獨特的鮮甜風(fēng)味。本研究以菌株蛋白酶活性為篩選重點，同時以淀粉酶和纖維素酶活性為參考依據(jù)，篩選有潛力促進(jìn)醬醪發(fā)酵的芽孢桿菌。用酪素平板法從發(fā)酵2、3、4 個月的醬醪中挑選出56 株蛋白酶活性較好的菌株。采用牛津杯法對菌株酶活性大小進(jìn)行復(fù)篩，得到11 株酪素水解圈較大的菌株，牛津杯法篩選高酶活性菌株省去了制曲環(huán)節(jié)，可減少工作量及篩選時間，實驗采用相同濃度的菌懸液，結(jié)果重復(fù)性好、誤差小。再將11 株蛋白酶活性強(qiáng)的菌株接種到牛津杯淀粉平板和牛津杯羧甲基纖維素鈉平板上，測量水解圈直徑。通過牛津杯法篩選出5 株酶活性強(qiáng)的菌株，其中菌株CS1.21、CS1.17、CS1.13蛋白酶活性較強(qiáng)，菌株CS1.12淀粉酶活性較強(qiáng)，菌株CS1.11纖維素酶活性較強(qiáng)（表1）。

表 1 菌株在不同平板上水解圈直徑Table 1 Hydrolysis circle diameters of selected strains on different plates

2.2 篩選菌株酶活性測定

圖 2 篩選菌株酶活性測定Fig. 2 Enzymatic activities of five selected strains

為測定篩選菌株酶活性及探究酶活性隨時間變化情況，按照1.3.4節(jié)方法分別將篩選得到的5 株芽孢桿菌接種到制曲培養(yǎng)基中，測定菌株的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活性（圖2）。通過對制曲不同時間樣品的酶活性測定發(fā)現(xiàn)，5 株菌蛋白酶活性在制曲第36小時達(dá)到最大，酶活性大小為CS1.13＞CS1.21＞CS1.17＞CS1.11＞CS1.12，其中菌株CS1.13蛋白酶活性最大，為6 500.2 U/g；淀粉酶活性在制曲第60小時達(dá)到最大，酶活性大小為CS1.11＞CS1.12＞CS1.21＞CS1.17＞CS1.13，其中菌株CS1.11淀粉酶活性最大，為59.2 U/g；纖維素酶活性在制曲第36～48小時達(dá)到最大，酶活性大小為CS1.17＞CS1.11＞CS1.13＞CS1.12＞CS1.21，其中菌株CS1.17纖維素酶活性最大，為3.42 U/g。通過比較5 株菌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶活性的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株CS1.11是產(chǎn)淀粉酶和纖維素的優(yōu)勢菌，有利于醬油發(fā)酵過程中還原糖的積累，為微生物的生長代謝提供營養(yǎng)；菌株CS1.13和CS1.17是產(chǎn)蛋白酶活性和纖維素酶的優(yōu)勢菌，有利于醬油發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和纖維素的水解，提升醬油中氨態(tài)氮及還原糖的含量，對改善醬油的滋味、促進(jìn)美拉德反應(yīng)有幫助，故對以上3 株芽孢桿菌進(jìn)行鑒定及發(fā)酵研究。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株CS1.11、CS1.13和CS1.17在50 g/L鹽質(zhì)量濃度牛肉膏蛋白固體平板上劃線培養(yǎng)48 h，菌落為乳白色，形狀不規(guī)則，中間區(qū)域有褶皺隆起。通過革蘭氏染色和芽孢染色實驗，確定3 株菌均為革蘭氏陽性菌、短桿狀、有芽孢產(chǎn)生（圖3）。

圖 3 3 株菌菌落和菌體形態(tài)Fig. 3 Colonies and morphological features of three strains with the highest enzymatic activity

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

以篩選菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將所得的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA檢測，得到單一、明亮、長度為1 600 bp左右的條帶（圖4）。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST核酸序列比對，下載同源性高的序列，通過MEGA7.0軟件進(jìn)行同源性分析，并使用軟件中的Neighbor-Joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），分支點數(shù)值是基于N-J法自展1 000 次后的自展值（≥50%）。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果將CS1.11鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）、CS1.13鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、CS1.17鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）?？莶菅挎邨U菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見微生物，以產(chǎn)酶種類豐富及較好的酶活性對發(fā)酵食品風(fēng)味做出貢獻(xiàn)；貝萊斯芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌近年來也在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過程中被分離和鑒定，有報道其對發(fā)酵食品的品質(zhì)有改善作用[6-7]。菌株CS1.11、CS1.13和CS1.17的培養(yǎng)及預(yù)備發(fā)酵實驗中發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生令人愉悅的醬香，且未發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵中產(chǎn)生變質(zhì)等不良影響，因此，對這3 株菌進(jìn)一步開展醬醪發(fā)酵研究，考察其對發(fā)酵的影響。3 株芽孢桿菌的16S rRNA基因序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中，并獲取登錄號（CS1.11：MN865798.1；CS1.13：MN865799.1；CS1.17：MN865800.1）。

圖 5 基于16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

2.4 添加芽孢桿菌促醬醪發(fā)酵研究

2.4.1 添加芽孢桿菌促醬醪發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

以本實驗室篩選并已報道對醬香有促進(jìn)作用的枯草芽孢桿菌CS1.03[23]為參照菌，采用與目前醬油發(fā)酵一致的原料，在不添加米曲霉的情況下，單獨對貝萊斯芽孢桿菌CS1.11、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌CS1.13和枯草芽孢桿菌CS1.17及CS1.03進(jìn)行制曲及鹽鹵發(fā)酵，研究其在醬醪發(fā)酵中的作用，測定發(fā)酵過程中壓榨醬油的理化指標(biāo)，其結(jié)果見圖6。醬油中的氨態(tài)氮主要是由蛋白酶水解原料中的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的，氨態(tài)氮含量能夠顯示釀造醬油的呈味能力，是國標(biāo)中釀造醬油分級的重要指標(biāo)[24]。以蒸煮豆粕和炒麥為原料添加芽孢桿菌制曲72 h，水解蛋白質(zhì)、淀粉等原料產(chǎn)生氨基酸、葡萄糖，為后期醬醪發(fā)酵提供充足養(yǎng)分，加入鹽水進(jìn)行鹽鹵發(fā)酵，發(fā)酵第0天，醬油中氨態(tài)氮含量大小為CS1.13＞CS1.17＞CS1.11，與上述菌株產(chǎn)蛋白酶活性大小保持一致，說明蛋白酶活性高的菌株在鹽鹵發(fā)酵初期能水解蛋白質(zhì)獲得較高的氨態(tài)氮含量；隨著發(fā)酵時間的延長，3 株實驗菌與對照菌樣品氨態(tài)氮含量均逐步升高，說明芽孢桿菌分泌的蛋白酶在較高鹽質(zhì)量濃度的醬醪發(fā)酵體系中能保持良好的酶活性，繼續(xù)分解蛋白質(zhì)獲得氨基酸；發(fā)酵第28天，添加CS1.13發(fā)酵醬油中氨態(tài)氮質(zhì)量濃度最高，為5.12 g/L，較對照菌CS1.03的發(fā)酵醬油提升了27.60%，在無米曲霉的醬醪發(fā)酵體系中，3 株實驗菌與對照菌發(fā)酵的醬油氨態(tài)氮含量均達(dá)到三級醬油標(biāo)準(zhǔn)（氨態(tài)氮≥4 g/L）?？梢哉f，所篩選的芽孢桿菌因其較好的蛋白降解能力而有利于提高醬醪中氨態(tài)氮的含量。還原糖對醬油的色、香、味、體均起著重要作用，不僅能為醬油提供甜味，還是美拉德反應(yīng)的主要反應(yīng)物。醬油發(fā)酵過程中還原糖含量的變化是原料中淀粉降解和還原糖消耗平衡的結(jié)果[25]。發(fā)酵第7天，3 株菌中CS1.11還原糖質(zhì)量濃度最高，為27.20 g/L，略高于CS1.03；在發(fā)酵初期，CS1.11和CS1.03發(fā)酵醬油中還原糖質(zhì)量濃度呈上升趨勢，說明還原糖的生成速率大于消耗速率；而淀粉酶活性較弱的CS1.13和CS1.17對還原糖含量影響不大，其發(fā)酵過程中還原糖質(zhì)量濃度變化也不明顯，分析原因應(yīng)為制曲結(jié)束后加入的鹽水使較弱的淀粉酶活性進(jìn)一步受到了抑制。微生物通過代謝糖類生成有機(jī)酸，能給醬油帶來爽口的感覺，但總酸含量過高的醬油很有可能已經(jīng)變質(zhì)[15]。對比產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌[26]，芽孢桿菌對醬油中總酸影響很小。3 株實驗菌發(fā)酵第28天總酸最高，為8.55 g/L，比對照菌CS1.03高出3.66 g/L，但均未超過國標(biāo)限定值（總酸≤25 g/L），不會影響醬油質(zhì)量。結(jié)合嗅聞測試，發(fā)酵樣品均未出現(xiàn)變質(zhì)氣味，因此，3 種實驗菌不是醬油釀造污染菌，且對醬油質(zhì)量指標(biāo)無不良影響。

圖 6 醬醪發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化Fig. 6 Changes in physicochemical indexes during moromi fermentation

2.4.2 添加芽孢桿菌促醬醪發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

芽孢桿菌能水解豆類等原料中的蛋白質(zhì)、淀粉并產(chǎn)生吡嗪類、醇類、酮類、酚類等風(fēng)味物質(zhì)，有助于醬香風(fēng)味的形成[27]。分析3 株實驗菌及對照菌CS1.03在上述發(fā)酵28 d所得醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括吡嗪類、醇類、酮類、酸類，這些物質(zhì)在市售醬油中均被檢出。對3 株實驗菌及對照菌CS1.03所發(fā)酵的醬油檢出次數(shù)較多和含量較高的16 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，如圖7所示，發(fā)現(xiàn)吡嗪類物質(zhì)、乙偶姻和2,3-丁二醇是添加3 株實驗菌及對照菌CS1.03發(fā)酵醬油的主體風(fēng)味物質(zhì)。吡嗪類物質(zhì)是醬香型白酒典型的風(fēng)味物質(zhì)，具有烘烤香氣，乙偶姻具有牛奶香，2,3-丁二醇具有水果香，這些物質(zhì)能賦予醬油更加豐富的風(fēng)味[28]。乙偶姻和2,3-丁二醇在2,3-丁二醇脫氫酶作用下可以相互轉(zhuǎn)換，發(fā)酵體系中的乙偶姻和氨轉(zhuǎn)化生成四甲基吡嗪，這3 類物質(zhì)的含量在芽孢桿菌代謝過程中相互促進(jìn)、彼此影響[29]。比較不同菌株間的產(chǎn)風(fēng)味特性發(fā)現(xiàn)，在添加CS1.11發(fā)酵的醬油中檢測到5 種吡嗪類物質(zhì)（2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪），且含量高于其他菌株發(fā)酵的醬油，CS1.11發(fā)酵醬油中吡嗪類物質(zhì)含量最高時達(dá)到5.47 mg/kg，而吡嗪類物質(zhì)生物合成的前體乙偶姻含量低，說明CS1.11的代謝途徑中能利用乙偶姻有效合成吡嗪類物質(zhì)；在添加CS1.13發(fā)酵的醬油中檢測出2,3-丁二醇含量最高，為5.33 mg/kg，說明CS1.13的優(yōu)勢是合成2,3-丁二醇；在添加CS1.17發(fā)酵的醬油中檢測出乙偶姻含量最高，為5.72 mg/kg，說明CS1.13最具合成乙偶姻的優(yōu)勢；在添加對照菌CS1.03發(fā)酵的醬油中吡嗪類物質(zhì)含量比3 株實驗菌小，但也是其發(fā)酵優(yōu)勢風(fēng)味物質(zhì)，除此之外，其發(fā)酵醬油中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量最高，為0.12 mg/kg，明顯高于其他樣品，說明對照菌CS1.03有別于3 株實驗菌的優(yōu)勢是合成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。此外，在添加CS1.11、CS1.13、CS1.17發(fā)酵醬油中還檢測出異戊酸、異丁酸和2-甲基丁酸，而添加CS1.03發(fā)酵的醬油中均未檢測到，這與理化指標(biāo)中總酸的測定結(jié)果相符，說明CS1.03產(chǎn)酸能力較弱。

圖 7 醬醪發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Fig. 7 Analysis of main volatile flavor substances in moromi during its fermentation process

3 結(jié) 論

采用牛津杯法從高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中篩選出3 株有促進(jìn)醬醪發(fā)酵潛力的芽孢桿菌CS1.11、CS1.13、CS1.17，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）；以枯草芽孢桿菌CS1.03為參照，分別將3 株實驗菌與對照菌CS1.03單獨進(jìn)行制曲后鹽鹵發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)CS1.13發(fā)酵醬油氨態(tài)氮含量最高，為5.12 g/L，較CS1.03提升了27.60%，有促進(jìn)醬醪中氨態(tài)氮形成的作用；CS1.11發(fā)酵醬油還原糖質(zhì)量濃度最高，為27.20 g/L，略高于CS1.03；此外3 株所篩選的實驗菌對醬油總酸含量影響不大，不是醬油釀造污染菌[15]。

對發(fā)酵過程中醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，檢出物質(zhì)主要包括吡嗪類、醇類、酮類、酸類，其中吡嗪類物質(zhì)及其前體乙偶姻和2,3-丁二醇是添加3 株實驗菌及對照菌CS1.03發(fā)酵的特征風(fēng)味物質(zhì)，與醬香型白酒大曲中芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)一致。四甲基吡嗪，又叫川芎嗪，具有烘烤、花生、榛子和可可香氣，具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)及抑制血小板積聚作用，是白酒中的健康因子以及主要功能性成分之一，也是中藥川芎治療心腦血管疾病的有效成分之一，提升吡嗪類物質(zhì)在醬油中的含量不僅能豐富醬油的風(fēng)味，還能賦予醬油健康及保健功能[17,30]。此外，分析四甲基吡嗪的生物合成途徑后發(fā)現(xiàn)，乙偶姻是糖代謝的產(chǎn)物，乙偶姻和2,3-丁二醇可以相互轉(zhuǎn)換，乙偶姻和氨轉(zhuǎn)化生成四甲基吡嗪，它們共同存在一條代謝途徑中。SPME-GC-MS定性及定量分析結(jié)果顯示3 株實驗菌及對照菌由乙偶姻代謝合成吡嗪類物質(zhì)的途徑活躍，其發(fā)酵醬油均形成了典型的醬香風(fēng)味，但其優(yōu)勢特征風(fēng)味物質(zhì)還存在一定的差異，這可能是與芽孢桿菌代謝過程中相關(guān)酶的活性及物質(zhì)代謝方向有關(guān)，后期可對所篩選的3 株芽孢桿菌進(jìn)行基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究，探索風(fēng)味物質(zhì)形成關(guān)鍵基因及機(jī)制，為充分利用芽孢桿菌釀造相關(guān)基因及種質(zhì)資源，提升醬油等發(fā)酵食品的風(fēng)味及品質(zhì)提供一條新思路。