肖 媚，李 閩，張 菡,2，彭幫柱,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.西安彩虹星球農(nóng)業(yè)科技有限公司，陜西 西安 710061）

蘋果果實中含有的大量多酚物質(zhì)簡稱為蘋果多酚，多存在于蘋果果肉、果皮、種子中[1]。在發(fā)酵過程中蘋果多酚物質(zhì)會從果實中浸出，存在于蘋果酒中。蘋果多酚具有抗氧化、抑菌等作用[2]，而且影響蘋果及其衍生產(chǎn)品的顏色形成、味道和風(fēng)味等感官品質(zhì)[3]。蘋果多酚中主要包括兒茶素類、原花青素類、酚酸類、二氫查耳酮類、黃酮醇類、花色苷類等多酚[1,4]。綠原酸是主要的酚酸類多酚物質(zhì)，在大部分蘋果成熟果實和發(fā)酵蘋果酒中其含量較其他多酚物質(zhì)高[5-6]。綠原酸由于芳香環(huán)上的鄰羥基而具有很高抗氧化活性[7]。

綠原酸在蘋果果實品種間的含量有較大差異，在大部分品種中綠原酸含量較高。李鑫[8]對35 個國內(nèi)品種蘋果進(jìn)行分析，果皮中綠原酸含量為0.02～2.76 mg/g（干質(zhì)量），果肉中含量為0.07～4.39 mg/g（干質(zhì)量），在果肉中含量普遍高于果實。在慶陽紅富士蘋果中綠原酸含量為0.106～0.154 mg/g[9]。Liaudanskas等[10]測定了多種歐洲品種蘋果果實中多酚，發(fā)現(xiàn)綠原酸是大部分品種蘋果果實中的主要多酚成分，酚酸含量為762.4～2 450.8 μg/g。綠原酸也是蘋果酒中豐富的酚酸物質(zhì)[11]。對寒富蘋果發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中總酚含量在發(fā)酵前期開始減少，發(fā)酵中期逐漸增加到最大值，后期逐漸減少趨于平穩(wěn)，綠原酸發(fā)酵初期質(zhì)量濃度在90 mg/L左右，最終產(chǎn)品中保留量為24.84 mg/L[12]。

通常酚類物質(zhì)含量及種類被研究者作為果酒品質(zhì)的評價指標(biāo)[13]。目前在果酒釀造方面的研究主要集中在酵母對酒中酚類成分和品質(zhì)的影響、篩選優(yōu)良發(fā)酵酵母菌種和篩選富含多酚物質(zhì)的水果[14-18]。關(guān)于酚類物質(zhì)對于酵母代謝影響機制研究很少。有研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒發(fā)酵過程中葡萄多酚會誘導(dǎo)酵母代謝和發(fā)酵動力學(xué)發(fā)生改變[19]，在釀造過程中，發(fā)酵初期原花色素多酚物質(zhì)對ATP質(zhì)膜活性具有抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長、CO2釋放、糖消耗和乙醇產(chǎn)量降低。在發(fā)酵3 d后，糖酵解途徑涉及的酶活性增強[20]。發(fā)酵過程中原花色素可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[21]。多酚可能通過葡萄糖轉(zhuǎn)運、能量和氧化還原穩(wěn)態(tài)以及糖酵解限速酶的活性對發(fā)酵產(chǎn)生重大影響[22]。另外有研究報道也證明多酚類物質(zhì)會在酵母活細(xì)胞內(nèi)累積，引起酵母生長和代謝紊亂，這可能是多酚與酵母質(zhì)膜的相互作用有關(guān)[19]。目前關(guān)于蘋果多酚對釀酒酵母作用機制鮮有研究報道。

釀酒酵母是蘋果酒發(fā)酵的主體，在將糖轉(zhuǎn)化成乙醇的過程中會面對各種脅迫和環(huán)境的變化，酵母也會對各種變化作出應(yīng)答。為揭示發(fā)酵過程中蘋果多酚物質(zhì)對釀酒酵母的影響，本研究選取蘋果多酚中含量較多的酚酸類物質(zhì)綠原酸為代表性多酚物質(zhì)進(jìn)行探討，以優(yōu)良釀酒酵母和純綠原酸為材料，應(yīng)用模擬發(fā)酵體系考察不同質(zhì)量濃度綠原酸的作用下釀酒酵母的代謝特征和香氣物質(zhì)變化，以期闡明蘋果多酚影響酵母代謝規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC31084中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；綠原酸（純度98%）上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP5002電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HH-2恒溫數(shù)顯水浴鍋 常州奧華儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；IS-RSV1恒溫振蕩箱 美國Crystal公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭 美國Supeleo公司；1510全波長讀數(shù)儀美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

液體酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[23]：酵母膏2 g，蛋白胨4 g，無水葡萄糖4 g，蒸餾水200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

模擬蘋果汁培養(yǎng)基：參考Yang Yindi等[24]方法略作修改，無水葡萄糖200 g/L，無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）20 g/L，用蘋果酸調(diào)節(jié)pH值至4.0。綠原酸添加到模擬培養(yǎng)基中，使綠原酸質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.1 g/L和1.0 g/L。YNB與綠原酸溶于水后過濾除菌，其他121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 菌種培養(yǎng)和模擬發(fā)酵

將斜面培養(yǎng)的酵母菌種接種于200 mL液體YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期中后期（20 h），酵母活化2 代，將活化后酵母菌液轉(zhuǎn)接到含有不同質(zhì)量濃度綠原酸的模擬汁培養(yǎng)基中，每瓶裝200 mL模擬蘋果汁培養(yǎng)基，接種量為1%，28 ℃靜置培養(yǎng)。定期取樣，-20 ℃保存。

1.3.3 CO2釋放量測定

采用CO2失重法[25]。發(fā)酵過程中，用電子天平稱質(zhì)量模擬汁發(fā)酵瓶（精確到0.01 g），稱前先搖晃發(fā)酵瓶，趕除CO2。計算各取樣時間點發(fā)酵瓶質(zhì)量差值為CO2釋放量。

1.3.4 釀酒酵母生長情況測定

取發(fā)酵過程中模擬汁發(fā)酵液，在波長600 nm處測定OD600 nm[26]，繪制生長曲線。

1.3.5 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicyclic acid，DNS）比色法[27]略作修改。

DNS試劑：將6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液加入到含185 g酒石酸鉀鈉的500 mL熱水中，再加入5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，用水定容到1 000 mL，貯于棕色瓶備用。

取發(fā)酵過程中模擬汁發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其糖質(zhì)量濃度在0.1～1.0 mg/mL之間，取稀釋液1.0 mL、DNS試劑1.5 mL于比色管中，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至15 mL，于波長540 nm處測定吸光度。按上述方法作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算葡萄糖含量。

1.3.6 乙醇含量測定

取發(fā)酵過程中模擬汁發(fā)酵液稀釋5 倍。取2 mL重鉻酸鉀溶液、1 mL稀釋樣品于10 mL比色管中，用蒸餾水定容，沸水浴10 min后流水冷卻至室溫，于波長600 nm處測定吸光度。按上述方法作乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算乙醇粗測含量。排除實驗中葡萄糖干擾，參考重鉻酸鉀-DNS比色方法進(jìn)行乙醇含量修正[28]。

1.3.7 香氣成分測定

通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行香氣成分測定，參照Yang Yindi等[24]方法略作修改。取4.8 mL發(fā)酵液上清液于15 mL頂空瓶中，加入2 g NaCl和0.2 mL 3-辛醇內(nèi)標(biāo)物（3-辛醇質(zhì)量濃度為327.2 μg/L），放入磁性轉(zhuǎn)子在45 ℃磁力攪拌器條件下平衡10 min，頂空萃取40 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流；色譜柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min后以3 ℃/min的速率升溫至120 ℃，再以8 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持10 min；載氣He；流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍50～550 u。

將香氣成分的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST 05質(zhì)譜庫進(jìn)行匹配定性分析。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度換算出香氣成分質(zhì)量濃度，計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016版本軟件，繪圖采用Origin 2018版本軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對釀酒酵母生物量的影響

在模擬汁發(fā)酵過程中，綠原酸對釀酒酵母CICC31084生長情況影響如圖1所示。不同質(zhì)量濃度綠原酸作用下，酵母細(xì)胞生長均有明顯的對數(shù)生長期與穩(wěn)定生長期。釀酒酵母生長進(jìn)入穩(wěn)定生長期的時間差異不大，分別在第4天（0 g/L綠原酸）、第5天（0.01 g/L綠原酸）、第3天（0.1 g/L綠原酸）、第5天（1.0 g/L綠原酸）。與對照組（0 g/L綠原酸）相比，0.01、0.1 g/L綠原酸作用下酵母生長數(shù)量差異不大，而高質(zhì)量濃度1.0 g/L綠原酸作用下釀酒酵母生長迅速，生長速率及數(shù)量明顯高于對照組。結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，綠原酸能促進(jìn)釀酒酵母細(xì)胞的生長。本研究結(jié)果與Li Jingyuan等[29]研究葡萄多酚作用效果一致。

圖 1 綠原酸對發(fā)酵過程中釀酒酵母生物量的影響Fig. 1 Effect of chlorogenic acid on biomass of S. cerevisiae during fermentation

2.2 綠原酸對CO2釋放量的影響

圖 2 綠原酸對發(fā)酵過程中CO2釋放量的影響Fig. 2 Effect of chlorogenic acid on CO2 emission during fermentation

如圖2所示，酵母生長到對數(shù)生長中期第2天時，CO2釋放量均達(dá)到最高，后逐漸降低。在發(fā)酵前期，與對照組（0 g/L綠原酸）相比，高質(zhì)量濃度1.0 g/L綠原酸作用下明顯增加了CO2釋放量，使發(fā)酵提前2～3 d結(jié)束。本研究CO2釋放量的變化趨勢與釀酒酵母生長趨勢一致，CO2的釋放是酵母細(xì)胞代謝途徑和能量利用的外部表現(xiàn)，結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度綠原酸的存在影響了釀酒酵母代謝途徑發(fā)生變化。

2.3 綠原酸對釀酒酵母糖代謝及乙醇生成的影響

如圖3a所示，在發(fā)酵過程中，葡萄糖被釀酒酵母不斷消耗，葡萄糖含量均在前5 d內(nèi)迅速下降。與對照組（0 g/L綠原酸）比較，質(zhì)量濃度為0.01 g/L的綠原酸延緩了酵母細(xì)胞對糖的利用，在第9天葡萄糖質(zhì)量濃度基本趨于0 g/L。質(zhì)量濃度為0.1 g/L的綠原酸在發(fā)酵中期加速了酵母對糖的利用，在第7天葡萄糖質(zhì)量濃度基本趨于0 g/L，與對照組相同。1.0 g/L綠原酸處理下，酵母細(xì)胞對糖的利用速率最高，與對照組相比，提前2 d消耗完葡萄糖。實驗結(jié)果與葡萄多酚對釀酒酵母糖代謝影響基本一致[29]。如圖3b所示，在發(fā)酵前4 d，綠原酸的存在延緩了乙醇的生成，4 d之后，各質(zhì)量濃度綠原酸作用下，乙醇快速增加，1.0 g/L綠原酸作用最為明顯。發(fā)酵后期乙醇生成量逐漸穩(wěn)定，且乙醇生成總量差異不大。綠原酸作用下，由于釀酒細(xì)胞生長速度加快，同時能促進(jìn)了糖的消耗，加快發(fā)酵進(jìn)程。而低質(zhì)量濃度綠原酸作用下發(fā)酵時間延緩，可能是釀酒酵母對綠原酸脅迫環(huán)境下的適應(yīng)反應(yīng)導(dǎo)致[19]。

圖 3 綠原酸對釀酒酵母葡萄糖代謝（a）和乙醇生成（b）的影響Fig. 3 Effects of chlorogenic acid on glucose utilization (a) and alcohol production (b) by S. cerevisiae

2.4 綠原酸對發(fā)酵過程中關(guān)鍵香氣成分的影響

蘋果酒中香氣物質(zhì)種類豐富，主要包括高級醇類、酯類、羧酸類、醛酮類等物質(zhì)。實驗選取蘋果酒關(guān)鍵香氣物質(zhì)苯乙醇、辛酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸異戊酯進(jìn)行分析。

2.4.1 醇類物質(zhì)變化

圖 4 發(fā)酵過程中香氣成分變化Fig. 4 Changes in aroma components during fermentation

苯乙醇是果酒高級醇類香氣物質(zhì)中的一種重要香氣化合物，具有愉悅的果香、蜜香[30]。發(fā)酵過程中苯乙醇主要是釀酒酵母通過莽草酸途徑或埃爾利希途徑從頭合成[31]。如圖4a所示，發(fā)酵過程中苯乙醇質(zhì)量濃度均逐漸增加，0.01、0.1 g/L綠原酸作用下苯乙醇含量低于對照組（0 g/L綠原酸），而高質(zhì)量濃度1.0 g/L綠原酸促進(jìn)了苯乙醇的合成。發(fā)酵4 d后，對照組苯乙醇含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定，而低質(zhì)量濃度下綠原酸作用下苯乙醇含量逐漸增加并高于對照組，高質(zhì)量濃度綠原酸作用下苯乙醇含量保持增加趨勢。結(jié)果表明，發(fā)酵結(jié)束時，綠原酸的添加均促進(jìn)苯乙醇的合成，而且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促進(jìn)效果與質(zhì)量濃度呈正比。綠原酸的存在可能影響釀酒酵母代謝途徑中關(guān)鍵酶和基因等發(fā)生改變，從而加快了醇類物質(zhì)合成。

2.4.2 酯類物質(zhì)變化

酯類香氣物質(zhì)是果酒中含量最多的物質(zhì)，對果酒的風(fēng)味有重要影響。發(fā)酵過程中乙酯類化合物是酵母細(xì)胞中短鏈脂肪酸在?；D(zhuǎn)移酶作用下與乙醇反應(yīng)合成，乙酸酯類化合物是乙醇或高級醇在醇乙?；D(zhuǎn)移酶作用下與?；o酶A反應(yīng)合成[31]。

辛酸乙酯具有芳香、甜香、杏味、香蕉味、菠蘿味風(fēng)味特征[32]。在發(fā)酵過程中（圖4b），辛酸乙酯含量在發(fā)酵前期和中期變化趨勢復(fù)雜，不同綠原酸質(zhì)量濃度下辛酸乙酯含量呈波動變化。發(fā)酵后期，辛酸乙酯含量均逐漸下降。發(fā)酵結(jié)束時，各質(zhì)量濃度綠原酸作用下辛酸乙酯含量與對照組差異不大。

乙酸乙酯具有甜香、果香風(fēng)味特征[32]。乙酸乙酯在整個發(fā)酵過程中含量持續(xù)增加（圖4c），在發(fā)酵后期，增長趨勢變緩。0.1 g/L綠原酸作用下乙酸乙酯含量均高于對照組，而低質(zhì)量濃度0.01 g/L、高質(zhì)量濃度1.0 g/L綠原酸作用下乙酸乙酯變化與對照組相同。

正己酸乙酯具有果香、酒香、蘋果味、香蕉味、菠蘿味風(fēng)味特征[32]。正己酸乙酯含量在發(fā)酵過程中先逐漸增加后降低（圖4d），對照組（0 g/L綠原酸）正己酸乙酯含量在第4天到達(dá)最高值，0.01、1.0 g/L綠原酸作用下在第6天最高值，發(fā)酵后期含量低于對照組。而0.1 g/L綠原酸作用下在第3天到達(dá)最高點，發(fā)酵后期含量與對照組差異不大。

癸酸乙酯具有甜香、油味、堅果味、酵母味風(fēng)味特征[32]。發(fā)酵過程中，癸酸乙酯含量在發(fā)酵前2 d變化趨勢基本相同（圖4e）。在發(fā)酵2～6 d，1.0 g/L綠原酸作用下癸酸乙酯含量逐漸高于對照組，0.1 g/L綠原酸作用下含量與對照組基本相同，而0.01 g/L綠原酸作用下癸酸乙酯生成速率逐漸降低。在發(fā)酵后期，綠原酸的存在降低了癸酸乙酯總量。

乙酸異戊酯具有果香、甜香風(fēng)味特征[32]。在發(fā)酵過程中，乙酸異戊酯含量均在一定范圍內(nèi)波動變化（圖4f）。0.1、1.0 g/L綠原酸作用下乙酸異戊酯含量明顯高于對照組，且質(zhì)量濃度越高，乙酸異戊酯含量越高。而0.01 g/L綠原酸作用下乙酸異戊酯含量在發(fā)酵中期高于對照組，在發(fā)酵前期和中期均低于對照組。結(jié)果與天然單寧對乙酸異戊酯作用相吻合[33]。

總的來說，發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)變化復(fù)雜，不同酯類之間變化趨勢不同，難以進(jìn)行比較。而發(fā)酵后期香氣成分趨于穩(wěn)定時，與對照組相比綠原酸作用下乙酸乙酯、乙酸異戊酯含量增加，正己酸乙酯、癸酸乙酯含量降低，而辛酸乙酯含量差異不大。

3 結(jié) 論

采用模擬蘋果汁體系進(jìn)行發(fā)酵，通過外源添加不同質(zhì)量濃度綠原酸，排除其他干擾因素，研究發(fā)酵過程中釀酒酵母在綠原酸脅迫下的發(fā)酵性能。研究結(jié)果表明：1.0 g/L綠原酸明顯促進(jìn)釀酒酵母CICC31084的生長，加快發(fā)酵前期CO2釋放以及糖的利用，使發(fā)酵完成提前2～3 d。高質(zhì)量濃度1.0 g/L綠原酸可以輕微抑制發(fā)酵前期乙醇的生成，發(fā)酵中后期乙醇生成加快，總乙醇生成量不變。關(guān)鍵香氣成分在不同質(zhì)量濃度綠原酸作用下變化較復(fù)雜，在發(fā)酵過程中綠原酸的存在明顯促進(jìn)苯乙醇、乙酸異戊酯的合成，而辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯在不同發(fā)酵時期受到綠原酸影響程度差異較大。在發(fā)酵末期香氣成分逐漸趨于穩(wěn)定時，綠原酸作用下苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯含量增加，正己酸乙酯、癸酸乙酯含量降低，而辛酸乙酯含量差異不大。

本研究表明發(fā)酵過程中綠原酸會誘導(dǎo)釀酒酵母生長代謝活動發(fā)生改變，從而導(dǎo)致釀造酒香氣成分發(fā)生改變，研究結(jié)果可為后期選擇綠原酸質(zhì)量濃度實驗提供理論依據(jù)，也為深入探討蘋果多酚對釀酒酵母發(fā)酵性能的影響機制提供理論支持。在后期工藝應(yīng)用中可以通過多種發(fā)酵技術(shù)改善和控制多酚物質(zhì)的濃度變化達(dá)到影響果酒發(fā)酵品質(zhì)的效果。