謝 科，翁 靜，李 騏，尚曉麗，楊 斌，錢興勇，劉 威△

1 楚雄醫(yī)藥高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)系，云南 楚雄675005；2 楚雄州人民醫(yī)院

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)一系列代謝紊亂綜合征，是嚴(yán)重危害人類身體健康的一種疾病。國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，2014 年全世界有3.87 億糖尿病患者，在高收入國家，2型糖尿病占85%～95%［1］。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活方式的改變（能量攝入增加和運(yùn)動減少等）及人口老齡化等因素的影響，2 型糖尿病的發(fā)病在全球范圍內(nèi)，尤其在發(fā)展中國家呈逐漸加重的流行趨勢［2］。目前尚缺乏根治糖尿病的藥物，多以西藥為主，能控制血糖，但隨著用藥時(shí)間的延長，耐藥性的出現(xiàn)，降糖效果降低，器官損害嚴(yán)重，出現(xiàn)各種糖尿病并發(fā)癥；中藥治療糖尿病具有降低血糖、減輕糖尿病對機(jī)體損害及控制、延緩糖尿病并發(fā)癥，保護(hù)靶器官，高效、低毒，較少產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢［3］。金剛藤，又名菝葜，相關(guān)研究［4］發(fā)現(xiàn)，其提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性，可有效抑制因胰島素抵抗導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝紊亂所啟動的氧化應(yīng)激機(jī)制，減少氧化應(yīng)激對胰島β細(xì)胞的損傷和功能抑制。小果倒地鈴為無患子科小果倒地鈴屬植物，有研究［5］發(fā)現(xiàn)小果倒地鈴葉乙醇提取物能降低血糖和糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c），增加胰島素和血紅蛋白水平。筆者團(tuán)隊(duì)就金剛藤+小果倒地鈴合劑（以下簡稱“合劑”）的降血糖作用進(jìn)行研究，探討合劑對成模小鼠的胰腺修復(fù)作用，為合劑藥理學(xué)的進(jìn)一步研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥及相關(guān)藥劑金剛藤和小果倒地鈴購自云南楚雄市藥材市場，已通過楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校相關(guān)專家鑒定。其中小果倒地鈴提取物由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)乙醇提取法取得。鹽酸二甲雙胍片（山東鳳凰制藥股份有限公司，批號：1803312）；胰島素檢測試劑盒(Mouse Insulin ELISA Kit，RayBiotech,貨號：Inc）；葡萄糖測試盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：193691）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美侖生物，批號：MB1227-1g）；三諾血糖測試紙（三諾生物傳感股份有限公司，批號：4801NB）；兔抗Tribble 同源蛋白3（TRIB3）多克隆抗體購自德國Calbiochem 公司；兔抗小鼠C/EBP 同源蛋白（CHOP）高親和性單克隆抗體購自美國Sigma公司。

1.2 儀器設(shè)備CA400型全生化自動分析儀（日本谷野株氏會社）；LD5-10 型離心機(jī)（北京醫(yī)療器械有限公司）；型移液槍（上海佳安分析儀器廠）；全自動血糖儀［艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司，型號（艾科·靈睿），標(biāo)準(zhǔn)編號：YZB/浙4540-2015］；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；9602A 酶標(biāo)儀（北京艾普生物設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物8 周齡KM 雄性小鼠30 只，體質(zhì)量（200±20）g，由楚雄醫(yī)藥高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：43004700050652，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.4 方法

1.4.1 動物模型制備與分組8 周齡KM 雄性小鼠30 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對照組10 只（空白對照組和合劑對照組）和造模組20 只，并測定兩組零基準(zhǔn)血糖值和初始體質(zhì)量；空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水，灌胃生理鹽水；合劑對照組常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg；各組按飼養(yǎng)方法飼喂4 周，每周測血糖和體質(zhì)量；第5 周開始將造模組小鼠腹腔注射STZ（40 mg/kg），連續(xù)注射5 天，對照組注射枸櫞酸鈉緩沖溶液；最后1次注射后72 h（禁食12 h）小鼠尾靜脈采血，血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠為建模成功小鼠，選擇15只成模小鼠。

1.4.2 給藥方法將成模小鼠隨機(jī)分為模型組、合劑組及二甲雙胍組。金剛藤小果倒地鈴合劑制備：采取水萃法，取金剛藤30 g與小果倒地鈴60 g混合，10倍加水量，浸泡1 h，煎煮3次，第1次2 h，第2、3 次1 h，提取液分別過濾合并，將濾液置蒸發(fā)皿中水浴蒸干，于105℃干燥3 h 取出稱重，將蒸發(fā)皿室溫放置0.5 h 后再干燥1 h 后稱重，反復(fù)操作，至兩次質(zhì)量差小于5%，掃出蒸發(fā)皿中的金剛藤小果倒地鈴干膏稱重備用，算出膏率和生藥含量系數(shù)并記錄；出膏率（%）=干膏質(zhì)量/生藥質(zhì)量×100%；生藥含量系數(shù)=生藥質(zhì)量/干膏質(zhì)量，計(jì)算所得干膏率為26.5%。將干膏換算成生藥含量并配制成0.675 g/mL濃度的溶液，冰箱冷藏備用。1）空白對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水，灌胃生理鹽水，連續(xù)8 周；2）合劑對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg，連續(xù)飼養(yǎng)8 周；3）模型組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃生理鹽水，連續(xù)8 周；4）合劑組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃合劑13.5 g/kg，連續(xù)8周；5）二甲雙胍組：飼喂高糖高脂飼料，正常飲水，灌胃二甲雙胍片溶液250 mg/kg，連續(xù)8周。

1.5 指標(biāo)檢測分別于給藥前和末次給藥后1 h測定成模組和對照組小鼠空腹血糖、血漿胰島素水平；切除小鼠部分胰腺組織勻漿后采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平；Western blot法檢測胰腺組織TRIB3及CHOP蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；各指標(biāo)間相關(guān)性采用多元線性回歸方程，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBG 和血漿胰島素水平FBG 和血漿胰島素水平空白對照組與合劑對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對照組和合劑對照組比較，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組空腹血糖升高，胰島素降低（P＜0.05）；與模型組比較，合劑組FBG降低，胰島素升高（P＜0.05），見表1。

2.2 炎癥指標(biāo)及TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)水平空白對照組和合劑對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白對照組、合劑對照組比較，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 升高（P＜0.05），合劑組低于模型組（P＜0.05），見表2—3、圖1。

2.3 炎癥指標(biāo)與相關(guān)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性TRIB3、CHOP 表達(dá)與TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表1 各組小鼠FBG和胰島素水平比較（±s）

表1 各組小鼠FBG和胰島素水平比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

表2 各組小鼠炎癥指標(biāo)比較（±s）

表2 各組小鼠炎癥指標(biāo)比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.0

圖1 TRIB3與CHOP蛋白表達(dá)水平（HE，×200）

表3 各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：#表示與空白對照組和合劑對照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

表4 炎癥指標(biāo)與相關(guān)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展均伴隨胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性減退，改善胰島β細(xì)胞功能、抑制β細(xì)胞凋亡是延緩2 型糖尿病進(jìn)展和并發(fā)癥發(fā)生的重要作用靶點(diǎn)［6］。盡管當(dāng)前可用的藥物（例如胰島素和其他降血糖藥物）可有效控制高血糖，但許多糖尿病患者最終會出現(xiàn)血管并發(fā)癥［7］。隊(duì)列研究［8］表明，殘留的β細(xì)胞功能可抵抗糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展，表明可以長期保存β細(xì)胞質(zhì)量/功能的治療方法具有重要價(jià)值，似乎內(nèi)源性胰島素釋放的增加較外源性胰島素替代具有多個(gè)優(yōu)勢。因此，在早期診斷的患者中保持β細(xì)胞存活并在慢性糖尿病患者中恢復(fù)β細(xì)胞質(zhì)量/功能將是糖尿病長期管理的一個(gè)重點(diǎn)。目前已有多項(xiàng)研究［9-10］顯示，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的因素較多，主要以高血糖狀態(tài)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及氧化損傷為主。在氧化損傷誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的多種途徑中，NF-κB 的活化、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的激活已引起關(guān)注，但具體機(jī)制尚未闡明。近年中藥制劑在糖尿病管理方面發(fā)揮了越來越重要的作用。諸多研究［11-12］表明，植物化學(xué)物質(zhì)，特別是類黃酮對糖尿病的預(yù)防和治療具有有益作用。研究含黃酮類成分的中藥制劑是否通過抑制氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及激活其抗氧化，抗炎和抗凋亡作用來保護(hù)胰腺β細(xì)胞并改善其功能進(jìn)而達(dá)到防治糖尿病的目的，已成為近年來相關(guān)專家關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，末次給藥后模型組、合劑組、二甲雙胍組空腹血糖水平高于對照組，血清胰島素水平低于對照組，且與模型組比較，合劑組FBG 水平更低，血清胰島素水平更高，說明金剛藤及小果倒地鈴合劑能夠有效降低機(jī)體血糖水平，保護(hù)胰腺β細(xì)胞功能和質(zhì)量。提示金剛藤提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性，可有效抑制因胰島素抵抗導(dǎo)致體內(nèi)糖脂代謝紊亂所啟動的氧化應(yīng)激機(jī)制，減少氧化應(yīng)激對胰島β細(xì)胞的損傷和功能抑制。小果倒地鈴為無患子科小果倒地鈴屬植物，CHINNADURAI等［4］研究小果倒地鈴葉的乙醇提取物降血糖作用，發(fā)現(xiàn)小果倒地鈴葉乙醇提取物能降低血糖和糖化血紅蛋白HbA1c 水平，增加機(jī)體胰島素和血紅蛋白水平。

此外，本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組、合劑組、二甲雙胍組TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 水平高于對照組，合劑組上述指標(biāo)水平低于模型組；且多元線性回歸分析結(jié)果顯示TRIB3、CHOP 表達(dá)與TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平存在正相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、加工修飾的重要場所，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)；持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會激活細(xì)胞凋亡通路［13］。胰島β細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其蛋白質(zhì)合成分泌旺盛，這就使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對β細(xì)胞功能和狀態(tài)極為敏感。糖尿病患者機(jī)體處于持續(xù)高血糖狀態(tài)，胰腺β細(xì)胞在長期高糖環(huán)境下會造成作為細(xì)胞器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于長期性應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞功能衰竭、損害細(xì)胞功能、減少細(xì)胞數(shù)量。這種高應(yīng)激狀態(tài)會導(dǎo)致胰島組織中產(chǎn)生大量炎癥因子，進(jìn)而出現(xiàn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，直接或間接作用于胰腺并損傷胰島β細(xì)胞。NF-κB 的高表達(dá)會啟動胰腺組織中的iNOS 因子，誘導(dǎo)NO 生成，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，造成胰島β細(xì)胞凋亡；TNF-α受體（TNFR-1）活化會觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號，最終導(dǎo)致Caspases-3 和-7 的激活，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡；TNFR-1 的活化能夠通過necrosome 的形成開始啟動β細(xì)胞自噬和壞死的通路［14］。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和FFA 的氧化會產(chǎn)生過量ROS/RNS，從而通過內(nèi)在途徑誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平的升高促進(jìn)了醛糖還原酶（一種消耗NADPH 的反應(yīng)）產(chǎn)生的山梨糖醇；NADPH 的耗盡會減少還原型谷胱甘肽（一種重要的細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑）的再生，從而使細(xì)胞易于受到氧化損傷，ROS/RNS 水平升高會破壞蛋白質(zhì)和DNA，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或觸發(fā)以自噬或壞死性死亡為終點(diǎn)的途徑［15］。TRIB3 是重要的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白，其通過調(diào)控下游炎癥因子、氧化因子、營養(yǎng)因子等來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。研究顯示［16］，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下抑制TRIB3 表達(dá)可降低細(xì)胞應(yīng)激損傷所造成的細(xì)胞程序性凋亡。CHOP 作為C/EBP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于普通狀態(tài)時(shí)，CHOP 蛋白處于低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)其表達(dá)會增加，故可作為衡量糖尿病動物胰島內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)［17］。

合劑的主要成分為金剛藤和小果倒地鈴，兩種中草藥的化學(xué)成分均含有類黃酮成分；黃酮類化合物可通過增強(qiáng)酶促（例如過氧化氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶，谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶，超氧化物歧化酶）和非酶促（例如還原型谷胱甘肽）抗氧化劑來增強(qiáng)糖尿病動物β細(xì)胞的抗氧化能力；抗氧化能力的提高抑制了β細(xì)胞中ROS 的積累和脂質(zhì)過氧化，因此可以保護(hù)它們免于自噬，凋亡或壞死。此外，有研究［18］表明，類黃酮對β細(xì)胞存活的有益作用與ER 應(yīng)激標(biāo)志物的減少有關(guān)。由于線粒體來源的ROS 在細(xì)胞因子敏感性NF-κB 的激活中起重要作用，因此類黃酮的抗氧化作用可能是抑制NF-κB激活和iNOS表達(dá)的原因。類黃酮可增加胰島素產(chǎn)生細(xì)胞中熱激蛋白（例如Hsp70）的基因表達(dá)［19］，熱休克蛋白70 的上調(diào)顯示增強(qiáng)了β細(xì)胞對NO、ROS和其他毒素（包括STZ）的抗性。

本研究受到實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量的限制，且金剛藤和小果倒地鈴降血糖的作用機(jī)理仍需進(jìn)一步化學(xué)分離和藥理學(xué)研究。

綜上所述，金剛藤與小果倒地鈴合劑可能具有通過抑制氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及激活其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用來保護(hù)胰腺β細(xì)胞并改善其功能的潛力。