楊圓圓，林芳珍，范冬梅，楊 銘*

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300020；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，天津 300020）

肝癌是世界第五大常見(jiàn)惡性腫瘤，在我國(guó)位列第二，近年來(lái)肝癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)［1］。至今，手術(shù)仍然是肝癌治療的首選，但僅有少數(shù)患者適合手術(shù)切除［2］。對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)和復(fù)發(fā)的肝癌患者，尋找藥物治療的新方法、新途徑仍是研究熱點(diǎn)。近年來(lái)腫瘤免疫治療的新策略和新思路得到廣泛的研究和發(fā)展，并為傳統(tǒng)治療注入新的活力。其中又以PD-1/PD-L1通路抑制劑在實(shí)體瘤中的治療效果最為顯著，目前已應(yīng)用于黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤。有文獻(xiàn)總結(jié)了免疫治療藥物發(fā)揮作用的三個(gè)要素［3］，即腫瘤的突變負(fù)荷、腫瘤內(nèi)部淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況以及PD-L1 的表達(dá)水平。CXCR3/CXCL10 趨化軸是T 細(xì)胞遷移的重要信號(hào)通路，CXCL10 可以招募多種免疫細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，提高患者總生存率。腫瘤部位CXCL10 的表達(dá)缺陷可能是造成腫瘤免疫逃逸的作用機(jī)制之一［4-6］?；谝陨涎芯?，筆者推測(cè)CXCL10 能夠促進(jìn)PD-1 抗體的抗腫瘤作用。本研究以腺病毒為載體使腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-1 抗體及趨化因子CXCL10，探討其對(duì)HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制，以期為腫瘤的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 裸鼠15 只（5～6 周齡，體重15～20 g，雌性），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為：SYXK（津）2020-0003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 電泳儀（型號(hào)：200/2.0 型，BIORAD 公司），全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon1600，上海天能），恒溫金屬?。ㄐ吞?hào)：DKT200-2A，杭州米歐儀器有限公司），恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermal Scientific），倒置顯微鏡（型號(hào)：CKX41，日本OLYMPUS），熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析儀（型號(hào)：ImageQuant LAS-4010，GE 公司），Synergy H4 多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy H4，Bio Tek公司），流式細(xì)胞分析儀（型號(hào)：FACSCantoII，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2、人胚腎細(xì)胞系293A 由本實(shí)驗(yàn)室保存。使用含10%FBS 及2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒包裝 包裝腺病毒所使用的穿梭質(zhì)粒為pAd-AFP-anti-PD-1-CXCL10，合成anti-PD-1 單鏈抗體及CXCL10 堿基序列。將穿梭質(zhì)粒與pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒正確重組后，根據(jù)Adeasy 腺病毒包裝手冊(cè)說(shuō)明于293A 細(xì)胞中包裝腺病毒。轉(zhuǎn)染10～14 d 后出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，反復(fù)凍融病毒上清三次收集為第一代病毒。繼續(xù)傳兩代收集第三代病毒，于-80 ℃保存。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 及MCF-7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/ml，接種于六孔板，待細(xì)胞沉于孔板底部后，按100 MOI 的感染復(fù)數(shù)分別加入腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10或?qū)φ詹《続d-track，48 h 后采用Western Blot 方法檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)分泌蛋白的表達(dá) 根據(jù)CXCL10 ELISA 檢測(cè)試劑盒（eBioscience）檢測(cè)病毒感染后細(xì)胞上清，具體操作如下：取50 μl Standards 或樣品加入酶標(biāo)板中（每個(gè)樣品設(shè)置復(fù)孔）。于所有復(fù)孔中分別加入50 μl 酶標(biāo)抗體，室溫封閉孵育30 min。260 μl Wash Solution 洗板4 次。每孔加入100 L TMB 底物液，室溫孵育10～15 min。每孔中加入50 μl 終止液以終止酶反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CXCL10 的濃度。

1.2.5 檢測(cè)活化T 細(xì)胞CD8 陽(yáng)性群體中CXCR3 陽(yáng)性率 取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，加入終濃度為0.5 μg/ml 的anti-CD3 及anti-CD28 抗體。于0、3、6 和9 d 收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8 陽(yáng)性細(xì)胞CXCR3 表達(dá)水平。

1.2.6 檢測(cè)共培養(yǎng)后HepG2 細(xì)胞PD-L1 陽(yáng)性率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，待細(xì)胞沉于板底部，以不同比例（2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1）加入活化后的T 細(xì)胞，72 h 后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2 細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)水平。

1.2.7 Transwell 檢測(cè)CXCL10 對(duì)T 細(xì)胞的趨化作用 取感染病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 后的HepG2 培養(yǎng)上清600 μl，并使用CXCL10 因子作為陽(yáng)性對(duì)照（終濃度為10 ng/ml）。將Transwell 小室放入孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)平衡1 h。期間，收集anti-CD3、anti-CD28抗體激活后的T 細(xì)胞1×106個(gè)置于上室。3 h 后，吸取300 μl 下室細(xì)胞，加入50 μl 計(jì)數(shù)Beads（123 count eBioscience），充分混勻后流式檢測(cè)Beads 所占比例，并計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對(duì)BALB/c 裸鼠HepG2 移植瘤生長(zhǎng)抑制作用 選用BALB/c 裸鼠（雌性，5～6 周齡，體重16～18 g）建立人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系移植瘤模型。接種前1 d，以300 cGy/只的劑量進(jìn)行γ 射線照射。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下接種，每只接種200 μl HepG2細(xì)胞懸液（5×106/只）。待腫瘤生長(zhǎng)至100～200 mm3時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每周兩次瘤內(nèi)注射濃縮后的腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，并經(jīng)尾靜脈注射活化后的T細(xì)胞（5×106/只）。隔日記錄腫瘤長(zhǎng)寬，并計(jì)算體積。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá) 如圖1 A所示，構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其正確性。Western blot 結(jié)果顯示，感染腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10（DOUBLE）后，HepG2 中anti-PD-1，CXCL10均能正確表達(dá)。而MCF-7 細(xì)胞由于缺乏AFP 啟動(dòng)子活性不能表達(dá)目的蛋白（圖1 B）。目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參灰度值之比見(jiàn)圖1 C。ELISA 結(jié)果表明HepG2 培養(yǎng)上清中分泌的CXCL10 濃度約為（1.35±0.33）ng/ml（圖1 D）。

2.2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細(xì)胞相互作用過(guò)程中激活 經(jīng)anti-CD3、anti-CD8 抗體活化后CD 8 陽(yáng)性T 細(xì)胞CXCR3 表達(dá)逐漸上調(diào)（圖2 A），CXCL10 可通過(guò)與其受體結(jié)合募集活化T 細(xì)胞。HepG2與活化后T 細(xì)胞相互作用可使其PD-L1 表達(dá)上調(diào)，并且PD-L1 陽(yáng)性比例隨效靶比例增加而進(jìn)一步升高，20∶1 時(shí)可達(dá)71.1%（圖2 B）。過(guò)往的研究中已經(jīng)證實(shí)T細(xì)胞激活后其PD-1 表達(dá)水平上調(diào)［7］，故PD-1/PD-L1通路可在效靶細(xì)胞相互作用過(guò)程中激活。

圖1 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)

圖2 CXCR3/CXCL10、PD-1/PD-L 通路在效靶細(xì)胞相互作用過(guò)程中激活

2.3 CXCL10 對(duì)活化T 細(xì)胞趨化作用 本研究采用Transwell 的方法在體外檢測(cè)活化后的T 細(xì)胞的趨化性，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 組與陽(yáng)性對(duì)照組（加入CXCL10 因子）不存在明顯差異，而對(duì)T 細(xì)胞趨化效果明顯強(qiáng)于對(duì)照組（Adtrack 感染組）（圖3）。說(shuō)明由感染病毒后的HepG2 細(xì)胞分泌的CXCL10 可有效募集活化T 細(xì)胞。

圖3 CXCL10 可趨化活化T 細(xì)胞

2.4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對(duì)BALB/c裸鼠HepG2 皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 濃縮腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10，50 μl/只瘤內(nèi)給藥治療，并以PBS 作為對(duì)照組，同時(shí)經(jīng)尾靜脈給予活化的T細(xì)胞。HepG2 細(xì)胞移植瘤裸鼠接受治療后，每3 d 測(cè)量一次腫瘤體積，動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示，盡管與PBS 組相比不具有顯著差異，腺病毒Ad-AFPanti-PD-1-CXCL10 可一定程度減慢HepG2 腫瘤的生長(zhǎng)，抑制率約為28.66 %，欠佳的治療效果可能與病毒用量及注射的T 細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 腺病毒Ad-AFP-anti-PD-1-CXCL10 對(duì)HepG2 皮下移植瘤的治療作用

3 討論

本研究聯(lián)合PD-1 抗體與趨化因子治療肝細(xì)胞癌，探討了相關(guān)理論基礎(chǔ)，證明了聯(lián)合用藥機(jī)制上的可行性，并對(duì)體內(nèi)抑瘤效果進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，以腺病毒為載體，受甲胎蛋白基因（alpha-fetoprotein，AFP）啟動(dòng)子操控的目的蛋白可在肝癌細(xì)胞HepG2 中特異表達(dá)，而不表達(dá)于MCF-7 乳腺癌細(xì)胞。HepG2 分泌的CXCL10 可以有效趨化激活的T 細(xì)胞。初步體內(nèi)試驗(yàn)表明該實(shí)驗(yàn)方案可以延緩腫瘤的生長(zhǎng)速度。

PD-1/PD-L1 抗體是免疫治療的新手段，但有相當(dāng)部分患者對(duì)其不響應(yīng)。目前開(kāi)發(fā)多種形式的聯(lián)合治療方案，提高PD-1 抗體的治療效果是研究熱點(diǎn)。PD-1/PD-L1 抗體是以調(diào)動(dòng)T 細(xì)胞活性為基礎(chǔ)的抗腫瘤方法，研究表明腫瘤部位淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，是影響其治療效果的重要因素。筆者推測(cè)使腫瘤局部高表達(dá)恰當(dāng)?shù)内吇蜃邮窃黾恿馨图?xì)胞浸潤(rùn)的有效方式［6］。CXCL10/CXCR3 是CD8 陽(yáng)性T 細(xì)胞遷移的信號(hào)軸，可募集激活狀態(tài)的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞。本研究中，筆者于體外證明了T 細(xì)胞激活后CXCR3 表達(dá)上調(diào)，并可被感染腺病毒的HepG2 分泌的CXCL10 有效募集。

在基因轉(zhuǎn)移載體的選擇上，腺病毒載體是目前在腫瘤治療的臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最多的載體，因其具有：宿主范圍廣，無(wú)致癌性，易于純化和濃縮，載體容量大等優(yōu)點(diǎn)。迄今，已知人腺病毒至少擁有近50 種血清型，大多數(shù)腺病毒載體都是基于血清型2 和血清型5。重組人Ad5 型腺病毒是我國(guó)唯一上市的病毒療法，已批準(zhǔn)用于腫瘤的輔助治療，將其作為新冠病毒疫苗的臨床試驗(yàn)也在開(kāi)展當(dāng)中。因此，在腫瘤的基因治療中，目前應(yīng)用較多的腺病毒載體仍是首選。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，可分泌PD-1 抗體及CXCL10 趨化因子的腺病毒并未產(chǎn)生預(yù)期的抑瘤效果。筆者推測(cè)有兩方面原因，一是瘤內(nèi)注射的給藥方式限制了病毒的使用量，經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)表明50 μl 為瘤內(nèi)注射劑量的上限，病毒劑量的不足可直接導(dǎo)致治療蛋白的分泌量不足。二是本實(shí)驗(yàn)采用免疫缺陷鼠，并單獨(dú)給予活化的T 細(xì)胞，推測(cè)T 細(xì)胞能夠在趨化因子的作用下向腫瘤組織聚集，同時(shí)PD-1 抗體能夠阻斷免疫抑制信號(hào)，增強(qiáng)T 細(xì)胞的殺傷作用。但單獨(dú)給予的異種來(lái)源T 細(xì)胞與經(jīng)過(guò)抗原提呈細(xì)胞活化的T 細(xì)胞有本質(zhì)區(qū)別，不具備識(shí)別腫瘤抗原的能力，因而僅具有非特異殺傷作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中筆者將采用人源化小鼠來(lái)解決腫瘤細(xì)胞異種移植帶來(lái)的免疫微環(huán)境缺失的問(wèn)題?？傊?，本研究以腺病毒為載體，聯(lián)合PD-1 抗體和趨化因子，為腫瘤免疫治療提供了新的思路。