伍迎歡，楊丹茹，趙燕英

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 青藏高原動(dòng)物保護(hù)與利用教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041)

奶牛乳腺炎是指在不同理化因素刺激下奶牛乳腺的炎性反應(yīng)，常由病原微生物的入侵引發(fā)[1]。作為奶牛4大疾病之一，奶牛乳腺炎嚴(yán)重影響了奶牛的健康和牛乳的產(chǎn)量及質(zhì)量，因而制約了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。目前，奶牛乳腺炎主要依賴抗生素治療。但抗生素的濫用，引發(fā)的病原菌耐藥性和牛奶中抗生素的殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重[3]。因此，闡明奶牛乳腺炎的病理本質(zhì)，尋找有效的治療手段非常必要。乳腺上皮細(xì)胞是乳房中乳汁的合成場(chǎng)所，更是血乳屏障的主要構(gòu)成者[4]。在乳腺炎的發(fā)生過(guò)程中，乳腺上皮細(xì)胞通過(guò)誘發(fā)炎癥而保護(hù)周圍組織[5]，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)則往往會(huì)損傷乳腺[6-7]。炎癥反應(yīng)通常由炎癥因子調(diào)節(jié)，乳腺中已檢測(cè)出多種炎癥因子[8-9]，但乳腺炎中炎癥因子的功能尚不清楚。

異體移植炎癥因子1 (allograft inflammatory factor-1，AIF-1)是一種主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的17 ku的炎性細(xì)胞因子[10-11]。首次從豬小腸中純化[12]，并在大鼠心移植排斥物中鑒定[13]。在人類，AIF-1基因定位于主要組織相容性復(fù)合物Ⅲ區(qū)域，臨近腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)和核因子κB(NF-κB)，提示其與免疫相關(guān)[14]。炎癥過(guò)程尤其是細(xì)菌感染，誘發(fā)了AIF-1的表達(dá)[15]。在患胰島炎的小鼠血液中，AIF-1的含量升高，而其抗體則阻止了胰島炎的發(fā)生[16]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AIF-1通過(guò)影響免疫細(xì)胞增殖、遷移[17-18]，細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19]在炎癥發(fā)生中扮演核心角色[20]。另一方面，AIF-1在進(jìn)化上高度保守，提示其功能的相似性[21]。考慮到AIF-1的免疫調(diào)節(jié)屬性，本研究探索了其對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生免疫介質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

試劑： Trizol、SYBR?Premix ExTaqTM(2×)、 pMD-19T載體購(gòu)自TaKaRa公司，TaqDNA聚合酶、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、PierceTMBCA蛋白分析試劑盒均購(gòu)自Thermo公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司；高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、0.25% Trysin購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸化IκBα抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1 ELISA試劑盒購(gòu)自 Bioswamp公司；牛異體移植炎癥因子1分析試劑盒購(gòu)自成都鵬世達(dá)實(shí)驗(yàn)用品有限公司。核因子κB的抑制劑 BAY 11-7085購(gòu)自MedChemExpress公司。

儀器：全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購(gòu)自上海天能公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭雷勃公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛AIF-1基因的克隆與序列分析 牛脾樣品采集于成都市青白江屠宰場(chǎng)。按照 Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取脾組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)得總RNA的OD值為 1.8～2.0。然后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以 Oligo (dT) 為引物合成cDNA。利用 Primer Premier 5.0 軟件，根據(jù)牛AIF-1 cDNA 序列信息(GenBank登錄號(hào)NM_173985)，以5′-AGCCATGAGCGAACTAGG-3′和反義5′-TCAGGGCAACTCAGAGATAG-3′為引物, 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增牛AIF-1的開(kāi)放閱讀框。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s， 57 ℃ 45 s和72 ℃ 45 s，共32個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物, 膠回收后, 將目標(biāo)片段克隆到pMD19-T質(zhì)粒中, 并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 進(jìn)行DNA測(cè)序。

以ExPASy-Tools(http://www.expasy.org/tools)預(yù)測(cè)牛AIF-1氨基酸序列、等電點(diǎn)和分子量。使用SignalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽，TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)定位。用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)鑒定結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型,用STRING (http://www.string-db.org/) 推導(dǎo)其相互作用蛋白。

1.2.2 牛AIF-1蛋白純化 利用NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶, 將牛AIF-1基因的開(kāi)放讀碼框亞克隆至pET32a 中。對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-AIF1進(jìn)行DNA測(cè)序, 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)。過(guò)夜培養(yǎng)后, 當(dāng)吸光度達(dá)到0.6時(shí), 用0.8 mmol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組牛AIF-1的表達(dá)，并用HisTrapTM HP 親和層析柱純化重組牛AIF-1蛋白。

1.2.3 牛乳中AIF-1含量測(cè)定 從成都一牧場(chǎng)采集56頭健康奶牛的牛乳、75頭患乳腺炎奶牛的牛乳和23頭患乳腺炎后康復(fù)的奶牛牛乳。離心去除牛乳中脂質(zhì)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，利用牛AIF-1檢測(cè)試劑盒測(cè)定牛乳中AIF-1的含量，在450 nm處檢測(cè)光吸收值。

1.2.4 牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 牛乳腺上皮細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)苗晉鋒教授惠贈(zèng)。培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的含雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下孵育。每3 d傳1代， 至第3代開(kāi)始試驗(yàn)。將1×105·mL-1MAC-T細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%，分別加入濃度為0.0、0.1、1.0、10.0 nmol·L-1牛AIF-1處理48 h。

1.2.5 腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1含量測(cè)定 AIF-1處理牛乳腺上皮細(xì)胞48 h后，輕輕吸取細(xì)胞上清，6 000 r·min-1離心，去除細(xì)胞雜質(zhì)。分別利用腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞外液中這3種細(xì)胞因子的含量，同樣在450 nm處檢測(cè)光吸收值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)牛乳腺上皮細(xì)胞IκBα的磷酸化水平 用含1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.5，10% 甘油，2% 巰基乙醇)制備細(xì)胞總蛋白。使用PierceTMBCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。再將硝酸纖維素膜在室溫下用含有5%牛血清白蛋白的TBST (20 mmol·L-1Tris-HCl， pH 7.6，0.14 mol·L-1NaCl，0.1% Tween 20) 封閉1 h。 然后，將膜與IκBα的磷酸化抗體(1∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜，并用TBST徹底清洗，然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗。用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)免疫復(fù)合物，以GAPDH為檢測(cè)內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 牛AIF-1基因的克隆與鑒定

利用RT-PCR技術(shù)克隆牛AIF-1基因，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其脫氧核苷酸序列與GenBank登錄的NM_173985序列一致。

該基因編碼1個(gè)147個(gè)氨基酸的多肽，含有1個(gè)QXXER基序和1個(gè)Ca2+結(jié)合的EF-Hand，分別位于19—23位氨基酸和58—69位氨基酸，與人AIF-1蛋白具有91.2%的相似性，如圖1所示。預(yù)測(cè)其牛AIF-1蛋白分子量為16.86 ku，等電點(diǎn)為6.04。經(jīng)SignalP4.0分析，該蛋白不是跨膜蛋白，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。InterProScan提示牛AIF-1是1種鈣離子結(jié)合蛋白，并可與肌動(dòng)蛋白相互作用。但STRING沒(méi)有發(fā)現(xiàn)牛AIF-1的配體。

2.2 牛AIF-1蛋白的純化

為了進(jìn)一步檢測(cè)牛AIF-1與乳腺炎的相關(guān)性，本研究純化了牛重組AIF-1蛋白。首先利用0.8 mmol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組牛AIF-1的表達(dá)，接著使用鎳離子親和層析，并用100 mmol·L-1咪唑洗脫融合蛋白。將洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分離(圖2)。

—.EF-hand 位置;- -.OXXER基序 —.EF-hand site; - -.OXXER motif圖1 牛異體移植炎癥因子1開(kāi)放讀碼框和氨基酸序列Fig.1 Open reading frame and deduced amino acid sequence of bovine AIF-1

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 上樣前細(xì)胞總蛋白；2. 上樣后0 mmol·L-1咪唑洗脫組分；3. 20 mmol·L-1 咪唑洗脫組分；4～8. 100 mmol·L-1咪唑洗脫組分；9～10. 500 mmol·L-1洗脫組分 M. Protein standard; 1. Total proteins before affinity chromatography; 2. The fraction eluted by 0 mmol·L-1 imidazole; 3. The fraction eluted by 20 mmol·L-1 imidazole; 4 to 8. The fraction eluted by 100 mmol·L-1 imidazole; 9 and 10. The fraction eluted by 500 mmol·L-1 imidazole圖2 牛異體移植炎癥因子蛋白純化SDS-PAGE圖譜Fig.2 Preparation of bovine AIF-1 protein

2.3 乳腺炎牛奶中AIF-1的含量測(cè)定

夾心ELISA檢測(cè)顯示，患乳腺炎奶牛牛乳中AIF-1的平均含量為(426.2±9.4)μg·L-1，顯著高于健康奶牛的(173.1±6.8) μg·L-1(P<0.001)，而抗生素治愈的奶牛牛乳中AIF-1的平均含量為(207.7±4.3)μg·L-1，與治療前有顯著差異 (P<0.001，圖3)。這些結(jié)果提示，牛AIF-1是1種分泌型蛋白，可能與乳腺炎相關(guān)。

2.4 AIF-1對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響

本試驗(yàn)利用ELISA法檢測(cè)牛AIF-1對(duì)腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1分泌的影響。如圖4所示，牛AIF-1以濃度梯度依賴的模式促進(jìn)了腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的分泌。這些細(xì)胞因子的上調(diào)可能募集免疫細(xì)胞到達(dá)乳腺，引發(fā)乳腺炎癥反應(yīng)。

***. P<0.001圖3 牛奶樣品中異體移植炎癥因子1的含量Fig.3 The concentrations of AIF-1 in milks

A. 腫瘤壞死因子α；B. 白細(xì)胞介素6；C. 單核細(xì)胞趨化蛋白1；***. P<0.001 A. TNF-α; B. IL-6; C. Monocyte chemoattractant protein 1; ***. P<0.001圖4 細(xì)胞外液中牛乳腺上皮細(xì)胞腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的含量Fig.4 Inflammatory cytokines secretion from bovine mammary epithelial cells induced by AIF-1

2.5 AIF-1對(duì)IκBα的磷酸化的影響

為了進(jìn)一步了解牛AIF-1誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子釋放的機(jī)制。本試驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)了IκBα的磷酸化。結(jié)果見(jiàn)圖5，牛AIF-1提高了IκBα的磷酸化水平，提示這些細(xì)胞因子的上調(diào)可能與核因子κB的激活相關(guān)。

2.6 BAY 11-7085阻止了AIF-1誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子分泌

為了探明AIF-1誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌與核因子κB激活的關(guān)系。本試驗(yàn)選用2.5 mg·L-1BAY11-7085 抑制核因子κB的激活。結(jié)果(圖6)顯示，BAY11-7085抑制了10.0 nmol·L-1的AIF-1所造成的腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的分泌增加。這些結(jié)果說(shuō)明AIF-1刺激的炎性細(xì)胞因子分泌是通過(guò)核因子κB引發(fā)的。

***. P<0.001圖5 利用Western blot檢測(cè)牛乳腺上皮細(xì)胞IκBα的磷酸化水平Fig.5 Phosphorylation of IκBα (Ser 32) was analyzed by Western blot

A. 腫瘤壞死因子α；B. 白細(xì)胞介素6；C. 單核細(xì)胞趨化蛋白1；***. P<0.001 A. TNF-α; B. IL-6; C. Monocyte chemoattractant protein 1; ***. P<0.001圖6 BAY11-7085對(duì)異體移植炎癥因子1刺激的細(xì)胞因子分泌的影響Fig.6 The effect of BAY11-7085 on inflammatory cytokines secretion from bovine mammary epithelial cells induced by AIF-1

3 討 論

奶牛乳腺炎是奶牛乳房的炎癥反應(yīng), 許多細(xì)胞因子都作為炎癥介質(zhì)參與了免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[22]。但與奶牛乳腺炎相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子尚未鑒定。AIF-1已被證實(shí)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用，并在多種炎癥相關(guān)疾病如異體移植排斥[23]、自身免疫疾病[24]、炎癥性血管病變[25]和癌癥[26]中大量表達(dá)。在本研究中，奶牛患乳腺炎后，牛乳中AIF-1的濃度也大幅增加。而奶牛痊愈后，牛奶中AIF-1的濃度也回落到正常水平，提示AIF-1可能與奶牛乳腺炎相關(guān)。

為了進(jìn)一步探討AIF-1與奶牛乳腺炎的關(guān)系，本研究克隆了牛AIF-1基因。結(jié)果顯示，牛AIF-1氨基酸序列與人AIF-1相似性極高(91.2%)，提示了其也可能具有免疫調(diào)節(jié)的功能。利用基因亞克隆和親和層析技術(shù)，本研究純化了牛AIF-1蛋白，為其功能研究奠定了基礎(chǔ)。

由于乳腺上皮細(xì)胞在乳腺的健康和疾病的防御中扮演重要角色。而在乳腺炎的發(fā)生過(guò)程中，乳腺上皮細(xì)胞將分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子[27]，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞并募集免疫細(xì)胞到達(dá)乳房[28]，加速乳腺炎的發(fā)生[29]。因此，本研究檢測(cè)了牛AIF-1對(duì)乳腺上皮細(xì)胞腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1分泌的影響。結(jié)果也證實(shí)牛AIF-1促進(jìn)了這3種細(xì)胞因子的分泌。Watano等[19]報(bào)道了小鼠AIF-1上調(diào)巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的產(chǎn)生， 這與本研究結(jié)果相一致。

炎癥因子的激活通常與核因子κB通路密切相關(guān)[30]。小鼠AIF-1激活了腹膜間皮細(xì)胞的核因子κB通路[31]。在本研究中，牛AIF-1也刺激了核因子κB的磷酸化，進(jìn)而激活了核因子κB。另一方面，抑制核因子κB信號(hào)，阻斷了AIF-1誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子釋放。

由此推斷，牛AIF-1是通過(guò)核因子κB信號(hào)激活炎癥因子TNF-α、IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的分泌。

4 結(jié) 論

奶?；既橄傺缀?，牛乳中異體移植炎癥因子1的水平顯著升高，而奶牛痊愈后，其牛乳中異體移植炎癥因子1的濃度回落到正常水平，提示異體移植炎癥因子1與乳腺炎可能相關(guān)。重組牛異體移植炎癥因子1通過(guò)核因子κB信號(hào)激活了炎癥因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和單核細(xì)胞趨化蛋白1的分泌，這些結(jié)果提示牛異體移植炎癥因子1可能具有與乳腺炎相關(guān)的免疫屬性。