呂芬芬，馬曉慧，汪 麗，馬 陳，張寶江，蘇 艷

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院 微生物實驗室，烏魯木齊 830052)

馬腺疫是由馬鏈球菌馬亞種(S.equi)引起馬屬動物的急性接觸性傳染病，可引起2歲以下馬匹發(fā)熱、咽炎、頭頸淋巴結腫大、化膿及流膿性鼻液，嚴重可造成馬匹死亡[1-2]。該病是馬屬動物最常發(fā)的傳染病之一，該病發(fā)病急，傳播快，在世界范圍內廣泛流行，并已造成很大經濟損失[3-4]。該病暴發(fā)后對有早期癥狀的病駒采用藥物治療有一定的療效，但治療完成后，馬容易再次患病。此外，該菌產生耐藥性的問題也變得日趨嚴重[5]。

疫苗是可有效預防和控制馬腺疫的重要措施，但對其研究還不夠成熟和完善。傳統(tǒng)的滅活全菌疫苗或提取物疫苗因具有較低的免疫效果而不被看好，目前，國外使用較多的馬腺疫疫苗主要有鼻腔接種的弱毒苗和肌內注射的蛋白亞單位苗。這兩類疫苗雖有一定效果，但也存在著安全性差和免疫效力低等問題[6-7]，因此，開發(fā)安全性好，免疫效果更佳的疫苗，可對有效防控該病提供技術支撐[8-9]。

S.equi的多抗原組成的亞單位疫苗可以彌補傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗的不足和缺陷，且不涉及感染性病原菌，生產和應用較為安全，成為馬腺疫疫苗發(fā)展的主要方向之一。SrtA為S.equi等多種革蘭陽性菌表面的一種分選酶[10]，可識別和酶解LPXTG基序，將表面蛋白錨定到細胞壁的肽聚糖上[11]，以往對豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)、A群鏈球菌(group Astreptococci，GAS)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)等菌的研究已表明SrtA可影響病原菌對宿主細胞的黏附、識別和定植[12-14]。SeM可在S.equi的抗吞噬和黏附過程中發(fā)揮主要作用，且可參與該菌的免疫逃避[15]。EAG是一種IgG結合蛋白，參與該菌的黏附、抗調理吞噬及免疫逃避，F(xiàn)lock等[16]研究表明，用EAG 免疫馬駒，該抗原對馬駒具有一定的免疫保護效果。

目前，已知EAG與CNE具有一定的相互協(xié)同作用。此外，Guss等[17]證明EAG、SclC和CNE蛋白聯(lián)合免疫后可部分保護馬駒抵抗S.equi的感染，最近的研究證明，以S.equi7種不同蛋白免疫馬駒，對駒的攻擊保護率可達到85%，這表明多抗原亞單位疫苗具有發(fā)展的潛力，但這種由7種蛋白組成的疫苗存在生產成本過高的問題。有關EAG、SeM和SrtA蛋白聯(lián)合免疫協(xié)同作用的研究未見報道，本研究在多層面和角度對這3種蛋白單獨及聯(lián)合免疫效果進行分析基礎上，綜合評價該亞單位疫苗組合的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6～8周齡18～22 g雌性昆明小鼠購自烏魯木齊市動物疾病預防控制中心，70只小鼠隨機分為5組， 每組14只，分別為SrtA免疫組、EAG免疫組、SeM免疫組、SeM+EAG+SrtA聯(lián)合免疫組和PBS對照組。

1.2 菌株及主要試劑

馬鏈球菌馬亞種ZZM-3株由新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室分離并保存；E.coliBL21(DE3)購自天根公司；大腸桿菌BL21由本室保存。E.coliBL21-pET-28a-SrtA、E.coliBL21-pGEX-4T-SeM、E.coliBL21-pET-28a-EAG由本實驗室構建和保存。

DNA Marker、中分子量蛋白 Marker 購自TaKaRa公司，HRP-IgG和分型抗體IgG、弗氏完全及不完全佐劑購自Sigma公司，TMB顯色液購自索萊寶科技有限公司。

1.3 SeM、EAG及SrtA的表達及純化

取E.coliBL21-pET-28a-SrtA、E.coliBL21-pGEX-4T-SeM、E.coliBL21-pET-28a-EAG表達菌株分別接種至含50 μg·mL-1的 kan+LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)6 h至菌液OD600 nm值為0.6時，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導6 h，破碎菌體并收集上清，用親和層析法進行純化及測定蛋白濃度。

1.4 動物免疫

將純化的重組蛋白與弗氏佐劑以體積比1∶1混勻，共免疫兩次，第一次免疫采用弗氏完全佐劑，第二次免疫抗原與弗氏不完全佐劑混合，免疫采取背部皮下注射，各免疫組小鼠的注射劑量為50 μg·只-1，首次免疫15 d后進行第二次免疫。首次免疫后0、14、35、45 d分別對小鼠尾靜脈采血，收集血清保存于-20 ℃。

1.5 血清抗體效價及亞型的ELISA檢測

用SrtA、EAG和SeM各100 ng作包被抗原，50 mmol·L-1的碳酸鹽作包被緩沖液 (pH9.6) 溶解抗原，用3種重組蛋白(300 ng·孔-1)4 ℃過夜包被ELISA板，用間接ELISA法[16]分別對免疫小鼠抗體效價和亞型進行檢測，將采集的小鼠血清作梯度稀釋，以1∶10 000稀釋的HRP山羊抗小鼠IgG為二抗，進行血清抗體效價測定。

IgG特異抗體分型采用方法同上，首次免疫后35 d小鼠血清以1∶300稀釋作一抗，HRP標記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 1∶6 000稀釋作為二抗，進行抗體亞型的檢測。

1.6 免疫保護試驗

第二次免疫后30 d，對免疫組及對照組小鼠攻毒，經腹腔注射馬鏈球菌馬亞種ZZM-3株，攻毒劑量為1 MLD (8.4×108CFU)，連續(xù)觀察12 d并記錄小鼠精神狀態(tài)、食欲、體重變化及死亡情況。

1.7 荷菌量測定及病理組織學觀察

攻毒后1 d，隨機選取4個試驗組和空白組小鼠各3只，取肝、脾、肺、腎組織研磨并梯度稀釋后涂布培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)后進行菌落計數。

攻毒后2 d，取免疫組及對照組小鼠各3只，取肝、脾、肺和腎組織用4%福爾馬林固定，制作石蠟切片，進行HE染色，對病理組織變化進行觀察。

1.8 q-RT PCR檢測免疫相關基因的轉錄

第二次免疫后7 d收集小鼠脾細胞，按照RNA提取說明書抽提各組組織總RNA。將重組質粒標準品稀釋6個梯度，構建標準曲線。以各組織總RNA為模板，根據GenBank 相關基因序列設計相關分子的引物(表1)，使用特異引物采用實時熒光定量RT-PCR擴增免疫相關基因IL-10、MHCⅠ、TCR、TLR2、TLR3、TLR4及RP105[18]，檢測用Quanti Tect RT-PCR kit (Qiagen)在BIO-RADiQ5熒光定量PCR儀上進行。

標準品和待測樣品均設置2個復孔進行檢測, 取其均值。反應體系:2×RT-PCR master mix 25 μL, 上下游引物各0.4 μmol·mL-1, Taqman 探針0.2 μmol·mL-1, RT mix 0.5 μL， RNA 樣品和標準品10 μL， 加nuclease-free water 補至50 μL。反應條件：95 ℃ 預變性3 min；然后95 ℃ 150 s； 60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。熔解曲線參數：55～95 ℃，每10 s上升0.5 ℃。然后進行定量分析。β-actin作為內參基因用來標定每個樣品的相對表達水平的差異，PBS作為對照組，采用2-ΔΔCt法分析免疫相關基因的相對表達水平[18]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.9 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1 重組蛋白的表達及純化

將3種不同的重組菌BL21-pET-28a-SrtA、BL21-pGEX-4T-SeM、BL21-pET-28a-EAG誘導表達后純化，將獲得的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果在24、64和27 ku分別出現(xiàn)明顯的目的條帶，與預期目的蛋白大小相符，表明成功表達、純化到EAG、SeM和SrtA重組蛋白 (圖1A～C)。

2.2 血清特異性抗體效價和IgG亞型的檢測

用3種不同抗原蛋白免疫小鼠，首次免疫后35 d 的抗體效價結果表明，免疫后可引起良好的抗體反應，各免疫組抗體效價均可達到1∶72 900，顯著高于對照組，且3種蛋白聯(lián)合免疫組抗體效價高于各重組蛋白單獨免疫組(圖2)。

A. SrtA的表達及純化; B. EAG的表達及純化; C. SeM的表達及純化; M. 蛋白質相對分子質量標準; 1～2. pET-28a-SrtA重組菌純化后蛋白; 3. pET-28a-EAG重組菌純化后蛋白; 4. pET-28a空載體誘導后的蛋白; 5. pGEX-4T-SeM重組菌純化后的蛋白 A. Expression and purification of SrtA; B. Expression and purification of EAG; C. Expression and purification of SeM; M. Protein molecular weight marker; 1-2. Purified SrtA recombinant protein; 3. Purified SrtA recombinant protein; 4. pET-28a empty vetor; 5. Purified SeM recombinant protein圖1 重組蛋白的表達、純化Fig.1 The expression and purification of recombinant proteins

對IgG亞型的檢測結果如圖3所示，3種抗原蛋白免疫后誘導的抗體亞型以IgG1和IgG2b為主，且聯(lián)合免疫組誘導的特異性IgG1和IgG2b抗體水平高于SeM、EAG與SrtA免疫組。

圖2 免疫小鼠血清抗體效價檢測Fig.2 Specific serum antibody titers in immunized mice

不同字母表示組間同種抗體亞型差異顯著(P<0.05) Different letters indicate significant differences of subtype detection among different groups(P<0.05)圖3 免疫小鼠血清抗體亞型檢測Fig.3 Antibody subtype detection in immunized mice

2.3 熒光定量PCR檢測

采集的第二次免疫后10 d各免疫組小鼠脾細胞，采用熒光定量RT-PCR方法對免疫相關基因進行檢測。SrtA免疫組MHCⅠ、TCR、TLR2、TLR3及TLR4的表達水平高于EAG和SeM免疫組，EAG免疫組誘導的IL-10水平最高，聯(lián)合免疫組MHCⅠ、RP105及TLR3的表達水平高于其他免疫組及對照組(圖4)。

2.4 小鼠攻毒保護試驗

首免后42 d對所有免疫組及對照組小鼠攻毒，腹腔注射1 MLD的S.equiZZM-3菌株。結果顯示PBS對照組小鼠在攻毒后3 d內全部死亡,EAG+SeM+SrtA聯(lián)合免疫組存活率為87.5%，顯著高于3種蛋白免疫組及對照組(圖5A)。各組小鼠體重在攻毒后4～5 d降低，免疫組體重在攻毒后5～6 d開始回升，除SeM免疫組和PBS對照組外各免疫組體重變化幅度較小，除PBS對照組外，各免疫組小鼠體重在攻毒后5 d恢復至正常(圖5B)。

2.5 荷菌量測定

攻毒后1 d，各免疫組及對照組小鼠肝、脾、肺、腎荷菌量的檢測結果顯示(圖6)，與對照組相比，3種 蛋白單獨免疫組及聯(lián)合免疫組各臟器荷菌量低于PBS對照組(P<0.05)。

2.6 病理組織學觀察

攻毒后2 d，分別取各試驗組小鼠肝、脾、肺、腎進行病理組織學觀察。

2.6.1 肝病理變化 肝病理組織學觀察如圖7所示，攻毒后2 d免疫組小鼠肝組織可見明顯出血，炎性細胞浸潤等肝病理損傷有不同程度改善(圖B、C和D)；3種蛋白聯(lián)合免疫組病理損傷最小(圖E)。

A. IL-10; B. MHC Ⅰ; C. RP105; D. TCR; E. TLR2; F. TLR3; G. TLR4; 不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) A. IL-10; B. MHC Ⅰ; C. RP105; D. TCR; E. TLR2; F. TLR3; G. TLR4; Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05)圖4 熒光定量PCR檢測免疫相關基因的相對轉錄水平Fig.4 The relative transcription level detection of immune related genes by fluorescence quantitative PCR

圖5 小鼠的攻毒保護率(A)和攻毒后的體重變化(B)Fig.5 The protection rate and body weight change in immunized mice after challenge

A.肝；B.脾；C.肺；D.腎。不同字母表示組間差異顯著(P<0.05) A. Liver; B. Spleen; C. Lung; D. Kidney. Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05)圖6 攻毒后小鼠各臟器荷菌量檢測Fig.6 The bacterial load of mice organs after challenge

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示臟器出血明顯 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates obvious bleeding and inflammatory exudation圖8 小鼠脾主要病理組織學變化(HE染色)Fig.8 Histopathological changes of spleen in mice(HE staining)

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示肺間隔增大明顯，炎性細胞滲出 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates that the pulmonary septum is enlarged and inflammatory cells exudate圖9 小鼠肺主要病理組織學變化(HE染色)Fig.9 Histopathological changes of lung in mice(HE staining)

A. 健康對照組; B. EAG組; C. SeM組; D. SrtA組; E. EAG+SeM+SrtA組; F. PBS組。箭頭指示臟器出血明顯 A. Healthy control group; B. EAG group; C. SeM group; D. SrtA; E. EAG+SeM+SrtA group; F. PBS group. The arrow indicates obvious bleeding and inflammatory exudation圖10 小鼠腎主要病理組織學變化(HE染色)Fig.10 Histopathological changes of kidney in mice(HE staining)

2.6.2 脾病理變化 脾病理組織學觀察如圖8所示，攻毒后2 d免疫組小鼠可見脾出血，炎性細胞增多(圖B、C和D)，3種蛋白免疫組小鼠脾出血較少，聯(lián)合免疫組的脾病變最小(圖E)。

2.6.3 肺病理變化 肺病理組織學觀察如圖9所示，攻毒后2 d PBS對照組小鼠可見肺間質增寬、斷裂，炎性細胞浸潤，各免疫組小鼠肺病理損傷有減輕(圖9B～D)，聯(lián)合免疫組肺病理損傷明顯減輕(圖9E)。

2.6.4 腎病理變化 腎病理組織學觀察如圖10所示，攻毒后各重組蛋白免疫組對該菌引起的小鼠腎間質充血，腎小管上皮細胞壞死脫落，腎小球嚢腔腫脹變大，空泡變性等病理損傷有明顯改善，3種蛋白聯(lián)合免疫組腎病理損傷最小。

3 討 論

馬腺疫俗稱“槽結”，高度傳染馬、騾和驢等馬屬動物，受到國內外的普遍重視[14]。因馬腺疫弱毒菌苗和滅活菌苗在免疫效果、安全性和價格方面還存在安全隱患、交叉保護性差等問題，迫切需要研制新型、高效、安全、價廉的疫苗。

S.equi毒力因子眾多，近年來隨著對細菌基因組及亞單位結構的深入了解，研制多價亞單位疫苗已成為可能。當前對亞單位疫苗的研究已顯示出良好的發(fā)展?jié)摿6, 8]，研究證明EAG、SclC及CNE免疫可以提供部分保護力[19-21]。類M蛋白(SeM)可抵抗吞噬細胞對該菌的吞噬作用，誘發(fā)高度保護性調理抗體[22-23]。EAG為該菌表面可與IgG 結合的毒力蛋白，可參與該菌的黏附、吞噬調理和免疫逃避[24]。本研究選擇了這兩種蛋白作為抗原組成成分，結果表明這兩種免疫原在免疫保護力和誘發(fā)抗體方面可以顯示出較佳的效果。

除了SeM 和EAG外，本研究中還選擇分選酶SrtA作為抗原成分之一。該酶是存在于多種革蘭陽性菌表面的轉肽酶，保守性好，主要參與該類病原菌的致病和黏附過程[25]，目前被認為是非常有潛力的新型抗菌靶標。有關SrtA的研究國外主要集中在金黃色葡萄球菌[14]，國內對該酶相關的研究較少，且主要集中在SrtA抑制劑的篩選方面[25]。Fan等[26]對A群鏈球菌的研究表明SrtA經黏膜免疫小鼠可誘導Th17介導的細胞免疫，對A群鏈球菌的交叉保護具有重要價值。Chen等[27]將A群鏈球菌SrtA與該菌毒力因子SCPA聯(lián)合免疫小鼠，攻毒后存活率較每種蛋白單獨免疫高，且能有效清除該菌的感染。為進一步探索具有Th17型細胞免疫誘導能力SrtA的聯(lián)合免疫效果，本研究中將S.equi的SrtA與保護性抗原EAG與SeM的聯(lián)合免疫小鼠，綜合分析證明該種免疫原可以與其他抗原聯(lián)合對S.equi感染產生良好的免疫保護效果。

SrtA與S.equi毒力因子SeM 和EAG聯(lián)合免疫小鼠，攻毒后組織荷菌量和免疫保護率得到顯著改善，3種蛋白聯(lián)合免疫較單獨免疫可顯著降低S.equi在肺、肝、脾及腎的定植及減輕這些組織的病理損傷，優(yōu)于于每種蛋白單獨免疫。這些結果表明這3種蛋白抗原在免疫效果和保護力方面可以發(fā)揮免疫協(xié)同作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)這3種抗原蛋白在誘導免疫相關分子的表達方面也顯示出優(yōu)勢。以往研究表明MHCⅠ類分子可遞呈內源性抗原肽，還可通過充當NK細胞和某些T細胞表面受體的配體，參與天然免疫應答過程[28]。本研究結果表明，SrtA蛋白單獨免疫可誘導MHCⅠ的表達，在聯(lián)合免疫中也表現(xiàn)出該誘導作用，推測SrtA可能通過MHCⅠ參與及誘導天然免疫。T 細胞受體(T cell receptor，TCR)是一種重要的信號轉導分子，在免疫應答過程中發(fā)揮著重要的靶向性作用[29]。本研究結果表明，SrtA分子單獨免疫可有效誘導TCR的表達，3種蛋白的聯(lián)合免疫結果也表明，SrtA可在聯(lián)合免疫過程中發(fā)揮對細胞免疫的誘導作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜糖蛋白模式識別受體，可在機體抵御病原菌的入侵中發(fā)揮重要作用[30]。Lecours等[31]發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌感染豬樹突狀細胞后，TLR2和TLR6的表達表現(xiàn)上調，而TLR1和TLR4的表達水平沒有變化，提示了TLRS可能參與豬鏈球菌感染宿主細胞后炎癥反應的發(fā)生。R?nnberg等[32]用S.equi攻擊TLR2缺失小鼠，發(fā)現(xiàn)TLR2 相關細胞因子的表達水平顯著下降，證明了S.equi可誘導細胞分泌細胞因子，可能與TLR2信號通路有關。國內杜潤慈等[33]的研究證明S.equi在感染后24 h，能顯著上調 RAW264.7 細胞TLR1、TLR2 及TLR6 mRNA 的表達。本研究結果表明，SrtA可誘導脾淋巴細胞中TLR2、TLR3及TLR4的轉錄，推測其在S.equi感染過程中是一個重要的免疫信號調節(jié)分子。

IL-10是Th2細胞分泌的一種抗炎細胞因子，參與炎癥抑制反應，還可刺激抗體的產生。杜潤慈等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，S.equi感染小鼠后IL-10的mRNA水平顯著升高。但這種誘導效果具體由該菌的哪些分子引起的還不明確。本研究結果表明，EAG免疫組IL-10表達水平顯著升高，且明顯高于其他2種蛋白和，該結果表明，S.equi的EAG蛋白在感染過程中可以發(fā)揮重要的抗炎作用。

Guss等[17]用S.equi的7種不同抗原蛋白免疫馬駒并攻毒，證明這7種蛋白聯(lián)合免疫保護率得到有效的提高，但這種多價亞單位疫苗仍存在著生產成本高的問題。本研究選擇了EAG、SeM及SrtA3種抗原免疫小鼠模型并攻毒，取得了良好的免疫效果。除了EAG外，本研究所選擇的免疫原與Guss等選擇的免疫原均不同，且免疫原數量少，有助于解決亞單位疫苗抗原成分過多生產成本過高的問題，未來還需要繼續(xù)開展本動物免疫試驗進行進一步的驗證。

4 結 論

采用3種不同抗原蛋白EAG、SeM及SrtA單獨及聯(lián)合免疫小鼠，有效誘導了免疫應答的產生，其中抗體亞型以IgG1和IgG2b為主，與單個抗原免疫相比，3種抗原蛋白聯(lián)合免疫可顯著降低S.equi在各臟器中的定植及對小鼠產生有效的攻毒保護。該結果可為馬腺疫亞單位疫苗的研究提供一定的數據參考。此外本研究還探索了抗原分子免疫對免疫分子表達水平的影響。