王遠霞，劉秀婷，章嘯君，項 云，徐 娥，呂文濤，楊 華，肖英平*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025； 2.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控 國家重點實驗室，杭州 310021； 3.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，杭州 310021； 4.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，金華 321017)

豬腸道菌群是一個復(fù)雜且動態(tài)變化的微生態(tài)系統(tǒng)，成年豬腸道細菌數(shù)量約為1014個[1]。但豬腸道菌群會受到多種因素的影響，如日齡等，仔豬剛出生時，腸道菌群組成不穩(wěn)定，隨著日齡增加，豬腸道菌群從單一向復(fù)雜逐漸演化，并逐漸形成以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)為主的菌群結(jié)構(gòu)[2]。Wang等[1]對不同生長階段豬腸道菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，布勞特氏菌屬(Blautia)和密螺旋體菌屬(Treponema)的相對豐度隨著日齡的增加而增加，大腸桿菌(Escherichia)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)相對豐度逐漸減少。劉穎[3]發(fā)現(xiàn)，梅山豬腸道中擬桿菌屬(Bacteroides)和梭桿菌屬 (Fusobacterium)隨著日齡的增加而減少。腸道菌群與脂肪沉積存在一定的相關(guān)性[1]，張麗萍[4]采用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，太湖豬和長白豬回腸內(nèi)容物的擬桿菌屬-普雷沃氏菌屬細菌數(shù)量隨著日齡增加而逐漸增加，與背膘厚變化呈正相關(guān)。腸道菌群對脂肪沉積的調(diào)控作用主要是通過影響其代謝活動和調(diào)節(jié)腸道中與脂肪代謝相關(guān)基因的表達來實現(xiàn)的[5]。脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acidbinding proteins, FABPs)存在于腸黏膜和其他利用脂肪酸的組織中，其中，F(xiàn)ABP1主要在哺乳動物的肝和小腸中表達，F(xiàn)ABP2特異性地在小腸中表達，F(xiàn)ABP4主要在脂肪細胞中表達[6]，參與細胞脂肪酸的吸收和運輸以及脂肪酸代謝平衡的調(diào)節(jié)，維持細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，在調(diào)節(jié)脂肪儲存和分布中發(fā)揮重要作用[7]。Zimmerman和Veerkamp[8]研究表明，無菌小鼠接種擬桿菌后回腸中FABP4表達量增加，增強了回腸細胞對脂肪酸吸收轉(zhuǎn)運的能力，從而促進了脂肪的吸收和機體脂肪沉積。Huang等[9]研究結(jié)果表明，低出生體重(LBW)仔豬回腸中FABP1、FABP2和FABP4表達水平和脂肪合成能力降低，且FABP1表達量與回腸微生物瘤胃菌屬UCG-008(RuminococcaceaeUCG-008)和霍氏真桿菌([Eubacterium]halliigroup)豐度呈正相關(guān)；FABP2和FABP4表達量與回腸微生物布勞特氏菌屬(Blautia)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)豐度呈負相關(guān)。

金華豬是我國重要的地方優(yōu)良品種，具有體脂含量高、肉質(zhì)好等特點，也是重要的肥胖或者脂肪沉積研究模型動物[10-11]。本實驗室前期就金華豬脂肪沉積與腸道菌群的關(guān)系開展了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)金華豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著不同于瘦肉型長白豬[12]，并且通過糞菌移植試驗也證明了金華豬的梭菌屬(Clostridium)、顫螺菌屬(Oscillibacter)和普雷沃菌(Prevoella)屬等可以促進脂肪的沉積[13]；通過對金華豬不同腸段微生物功能分析發(fā)現(xiàn)，回腸微生物可能有助于金華豬攝入較多脂肪從而促進體脂沉積[11]，但目前,關(guān)于豬小腸(例如回腸)中腸道菌群結(jié)構(gòu)與脂肪沉積的研究較少。因此，本試驗選擇不同日齡的金華豬為研究對象，重點分析金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)的發(fā)育性變化以及與脂肪酸結(jié)合蛋白和背膘厚的相關(guān)性，為調(diào)節(jié)豬的脂肪沉積和改善肉質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

在金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗?zāi)翀鲞x擇同批次的60頭金華豬進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間，自由采食和飲水，預(yù)防免疫和飼養(yǎng)管理按常規(guī)方法進行。分別在45(D45)、90(D90)、150(D150)和270(D270)日齡各選擇4頭金華豬公豬。日糧組成及主要營養(yǎng)成分見表1。屠宰前禁食12 h，稱重屠宰，并測定其背膘厚，具體參照王富國等[14]的測定方法，分別測定豬前部(肩部最厚處)、6～7肋骨處、中部(胸腰椎結(jié)合處)和后部(腰薦結(jié)合處)背膘厚，然后取平均值。迅速采集回腸中段內(nèi)容物用于菌群結(jié)構(gòu)分析；參照Wang等[15]的方法采集回腸黏膜，具體方法：取回腸中段2～3 cm腸道組織，剪開后在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，于平皿內(nèi)刮取回腸黏膜，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，置于液氮速凍，于干冰中轉(zhuǎn)運至實驗室，-80 ℃保存。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2 脂肪酸結(jié)合蛋白基因熒光定量PCR分析

使用TRIzol?Plus RNA Purification Kit提取回腸黏膜RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照Huang等[9]的引物序列(表2)對金華豬回腸黏膜的脂肪酸結(jié)合蛋白基因FABP1、FABP2和FABP4進行熒光定量PCR分析，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR使用Power SYBR?Green PCR Master Mix在CFX384多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)中進行，qRT-PCR擴增體系為20 μL：SDW 8.0 μL,Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL,上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s, 63 ℃ 25 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)三次，各個基因的相對表達水平以2-ΔΔCt進行統(tǒng)計分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 基因組DNA提取

采用QIAamp Stool Mini Kit (QIAGEN, CA)試劑盒提取金華豬回腸內(nèi)容物微生物基因組DNA，使用Nanodrop 2000測定所提取DNA的純度和濃度。

1.4 PCR反應(yīng)和高通量測序分析

測序由明科生物技術(shù)(杭州)有限公司完成，使用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)對細菌16S rRNA基因V4～V5進行PCR擴增，采用Illumina Hiseq高通量測序平臺進行測序，按照97%相似性對非重復(fù)序列進行OTU聚類，使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫對所有OTU的代表性序列進行物種匹配。采用主坐標分析(principal coordinate analysis, PCoA)進行樣品間beta多樣性分析。

1.5 統(tǒng)計分析

不同日齡金華豬的體重、背膘厚、菌群相對豐度和脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用GraphPad Prism 8軟件作圖，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。金華豬回腸菌群豐度與脂肪酸結(jié)合蛋白和背膘厚的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)系數(shù)進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同日齡金華豬體重和背膘厚

由圖1可知，隨著日齡的增加，金華豬體重和背膘厚均顯著增加(P<0.05)。在45、90、150和270日齡 時金華豬的平均體重分別為9.79、22、42.35和92.60 kg(圖1A)，背膘厚分別為13.0、16.0、22.0和37.6 mm(圖1B)。

2.2 不同日齡金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達水平

通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加，金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白FABP1、FABP2和FABP4基因表達均顯著上升(P<0.05)(圖2)。與45日齡 相比，F(xiàn)ABP1表達量在270日齡升高了123.09%(P=0.014)；FABP2表達量在150和270日齡 分別升高了65.04%(P=0.021)和93.52%(P=0.002)；FABP4表達量在150和270日齡分別升高了64.5%(P=0.012)和102.81%(P<0.001)。

2.3 不同日齡金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)

隨著金華豬日齡的增加，菌群OTU數(shù)目、香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)均呈先降低后升高的趨勢(表3)；各日齡覆蓋度指數(shù)也均大于0.99，說明了該測序結(jié)果可以代表樣本中菌群的真實情況。

對不同日齡金華豬的回腸菌群結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上(圖3)，優(yōu)勢菌門主要是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)；其中，厚壁菌門相對豐度在各日齡均大于90%，為絕對優(yōu)勢菌門。

圖中值均為“平均值±標準誤”；數(shù)據(jù)柱上小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同 All exprimental data are expressed as the “mean±standard error”; Value columns with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05), while the same lowercase letter means no sigificant differences(P>0.05). The same as Figure 2圖1 不同日齡金華豬體重和背膘厚Fig.1 Body weight and backfat thickness of Jinhua pigs at different ages

圖2 不同日齡金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達水平Fig.2 Expression of fatty acid binding protein genes in the ileum of Jinhua pigs at different ages

在屬水平上，相對豐度最高的10個優(yōu)勢菌屬分別為狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、土孢桿菌屬(Terrisporobacter)、Romboutsia、鏈球菌屬(Streptococcus)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、擬桿菌屬(Bacteroides)、埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、八疊球菌(Sarcina)和Muribaculaceae_norank；在45、90日齡時狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)和乳酸菌屬(Lactobacillus)為主要優(yōu)勢菌屬；而在150日齡時乳酸菌屬(Lactobacillus)取代了狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)成為相對豐度最高的優(yōu)勢屬，其相對豐度為58.50%，顯著高于其他日齡(P<0.05)；270日齡時，Romboutsia成為腸道的第一優(yōu)勢菌屬，其相對豐度為28.16%。

通過對相對豐度最高的50個菌屬進行熱圖分析發(fā)現(xiàn)，不同日齡金華豬回腸中的優(yōu)勢菌屬不同，具有明顯的動態(tài)演替特征(圖4)。

對不同日齡金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)進行PCoA(圖5)發(fā)現(xiàn)，各日齡有顯著不同的聚類，說明不同日齡金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。

2.4 金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白表達和背膘厚的相關(guān)性

對金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白表達和背膘厚的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表4)，金華豬回腸脂肪酸結(jié)合蛋白FABP1、FABP2和FABP4表達與背膘厚呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.480 1，0.597 9和0.795 3。

2.5 金華豬回腸菌群與脂肪酸結(jié)合蛋白表達和背膘厚的相關(guān)性

對金華豬回腸菌群與脂肪酸結(jié)合蛋白表達和背膘厚的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，Epulopiscium和Mycoplasma相對豐度與FABP1、FABP2和FABP4表達量和背膘厚均呈正相關(guān)(ρ范圍0.38～0.76)；丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、Erysipelatoclostridium、擬桿菌屬(Bacteroides)和顫螺菌屬(Oscillibacter)相對豐度與背膘厚呈正相關(guān)(ρ范圍0.50～0.58)；Delftia和擬普雷沃菌屬(Alloprevo-tella)相對豐度與FABP2表達量呈負相關(guān)(ρ范圍-0.50～-0.56)；狹義梭菌屬1(Clostridiumsensestricto1)和狹義梭菌屬6(Clostridiumsensestricto6)相對豐度與FABP4表達量和背膘厚呈負相關(guān)(ρ范圍-0.43～-0.62)。

表3 不同日齡金華豬回腸菌群樣品測序結(jié)果

3 討 論

不同生長階段豬腸道的菌群多樣性、結(jié)構(gòu)和組成不同，可能與飼糧或腸道生理相關(guān)[1]。本研究中，alpha多樣性分析表明，金華豬回腸菌群的香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)隨著日齡的增加均呈先降低后增加的趨勢。劉穎[3]對梅山豬不同發(fā)育階段腸道微生物變化的研究發(fā)現(xiàn)，小腸菌群多樣性呈先降低后增加的趨勢，與本研究結(jié)果相一致。對金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，不同日齡階段回腸的優(yōu)勢菌門均以厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主，二者占金華豬回腸菌群的相對豐度為95%左右，其中厚壁菌門占回腸菌群的90%以上，與本實驗室前期[13]和Isaacson和Kim[16]研究結(jié)果一致。在屬水平上，金華豬回腸中狹義梭菌屬1(Clostridiumsensustricto1)、乳酸菌屬(Lactobacillus)是相對豐度最高的菌屬。Looft等[17]研究發(fā)現(xiàn)，杜長大豬回腸中相對豐度最高的菌屬是蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)和厭氧桿菌屬；Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在萊蕪豬回腸中相對豐度最高的是梭菌屬，不同研究的腸道菌群豐度差異可能是由于品種、日齡和環(huán)境等造成的。在270日齡時，Romboutsia和土孢桿菌屬(Terrisporobacter)相對豐度顯著升高說明了金豬豬腸道中的共生益生菌從前期狹義梭菌屬 1、乳酸菌屬為主演替成Romboutsia和土孢桿菌屬(Terrisporobacter)為主。有研究表明，Romboutsia具有益生性，與腸道健康密切相關(guān)[19]。

隨著豬日齡的增加，其腸道菌群發(fā)生變化，脂肪沉積或與脂肪沉積相關(guān)基因的表達也發(fā)生相應(yīng)變化[18]。FABPs是脂肪儲存與分配的關(guān)鍵介質(zhì)，在調(diào)節(jié)脂肪的儲存和分布中發(fā)揮重要作用[6-7]，且Zimmerman和Veerkamp[8]與Huang等[9]研究表明，回腸FABPs的表達水平與腸道菌群的變化密切相關(guān)。本研究表明，Epulopiscium和Mycoplasma與FABP1、FABP2和FABP4表達水平呈正相關(guān)。Epulopiscium可以編碼碳水化合物酶如A.sohal和Naso，促進纖維多糖類的降解與消化[20]；Mycoplasma屬于產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬，可為腸上皮細胞提供能量并降低腸道炎癥[21]。因此，金華豬回腸Epulopiscium和Mycoplasma相對豐度與FABP1、FABP2和FABP4表達水平和背膘厚呈正相關(guān)可能是其通過促進纖維多糖類的降解和產(chǎn)生短鏈脂肪酸、降低腸道炎癥反應(yīng)等促進了FABPs的表達，增強了回腸細胞吸收和轉(zhuǎn)運脂肪酸的能力[22]，從而導(dǎo)致金華豬脂肪沉積量能力增強。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬(Bacteroides)和顫螺菌屬(Oscillospira)與背膘厚呈正相關(guān)；擬桿菌屬(Bacteroides)可促進與回腸脂類物質(zhì)吸收相關(guān)的酶類mRNA表達[23]；顫螺菌屬(Oscillospira)能促進宿主能量吸收從而導(dǎo)致脂肪沉積[24]。這部分解釋了這些菌屬與脂肪酸結(jié)合蛋白的發(fā)育性變化與脂肪沉積呈現(xiàn)相關(guān)性的原因。

圖3 不同日齡金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Microbial community structure in the ileum of Jinhua pigs at different ages

圖4 金華豬回腸中相對豐度最高的50個菌屬熱圖Fig.4 Heatmap of 50 genera with the highest relative abundance in the ileum of Jinhua pigs

圖5 不同日齡金華豬回腸菌群結(jié)構(gòu)主坐標分析Fig.5 PCoA plot of microbial community structure in the ileum of Jinhua pigs at different ages

表4 脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達與背膘厚的相關(guān)性

圖6 金華豬回腸菌群與脂肪酸結(jié)合蛋白基因表達和背膘厚的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of ileal microbial community structures with fatty acid binding protein genes expression and backfat thickness in Jinhua pigs

4 結(jié) 論

金華豬回腸優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，優(yōu)勢菌屬為狹義梭菌屬 1、乳酸菌屬、土孢桿菌屬、Romboutsia和鏈球菌屬；在屬水平上菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)發(fā)育性變化?；啬c菌屬Epulopiscium和Mycoplasma相對豐度與脂肪酸結(jié)合蛋白FABP1、FABP2和FABP4基因表達水平和背膘厚呈正相關(guān)，推測Epulopiscium和Mycoplasma可能通過調(diào)控脂肪酸結(jié)合蛋白表達來調(diào)節(jié)豬的脂肪沉積。