楊 花，趙欣月，萬 珍，王 鋒，張艷麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 羊業(yè)科學(xué)研究所，南京 210095)

17β-羥類固醇脫氫酶12(HSD17B12)是一種典型的雌激素性17β-HSD[1]。哺乳動物的HSD17B12最早被認為是一種酮酰CoA還原酶，參與脂肪酸鏈的延長[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，HSD17B12的表達會受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)的影響，與參與膽固醇和脂肪酸等生物合成的基因相似[4]，其會進一步影響類固醇的產(chǎn)生。此外，該酶在類固醇激素生成通路中富集，可將雌酮(E1)轉(zhuǎn)化為雌二醇(E2)，并且一定程度上催化雄烯二酮轉(zhuǎn)化為睪酮[5]，與動物的生殖密切相關(guān)[6-7]。Kemil?inen等[8]發(fā)現(xiàn)，HSD17B12能通過調(diào)節(jié)前列腺素的分泌影響卵巢的功能，進而影響雌性生殖。此外，HSD17B12敲低會誘導(dǎo)乳腺癌細胞系的生長抑制[9]。HSD17B12過表達可能對卵巢健康有不利影響，提升卵巢癌細胞活性[10]。有研究表明，HSD17B12在卵巢漿液性腺癌中呈高表達，且在臨床不同時期表達不同[11]。Ijiri等[12]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鮭魚垂體提取物誘導(dǎo)后的卵巢顆粒層中，HSD17B12類似物的含量顯著上升，推測該現(xiàn)象與HSD17B12和垂體對鮭魚生殖系統(tǒng)的影響有關(guān)。HSD17B12也被發(fā)現(xiàn)與魚類卵母細胞成熟過程緊密相關(guān)[13]。此外，HSD17B12參與了花生四烯酸的合成，對于胚胎發(fā)生過程中正常的神經(jīng)元發(fā)育至關(guān)重要[14]?；蚨鄳B(tài)性分析也表明，HSD17B12可能與豬產(chǎn)仔數(shù)存在一定聯(lián)系[15]。綜上表明，HSD17B12在動物生殖中具有重要作用。

垂體作為動物體主要生理過程的中樞調(diào)節(jié)器，可通過調(diào)節(jié)細胞群的分泌來響應(yīng)機體內(nèi)激素的變化和下丘腦的狀態(tài)[16-17]。其分泌的激素主要為促性腺激素(卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH))等，對性腺的發(fā)育和生殖活動有直接影響[18-20]；此外，生長激素(GH)也作為垂體分泌的對動物生長調(diào)控具有重要作用的多功能激素，在垂體發(fā)育、垂體腺瘤、激素缺乏癥等臨床疾病中有大量研究[21-23]。前期研究發(fā)現(xiàn)，HSD17B12在湖羊垂體、下丘腦中呈高表達，性成熟前后湖羊垂體組織lncRNA和mRNA高通量測序結(jié)果表明，HSD17B12可顯著富集在類固醇激素合成相關(guān)通路中，并且是一種差異表達lncRNA的靶基因，干擾該lncRNA的水平可顯著降低HSD17B12的表達，且降低垂體細胞中的激素分泌水平[24]，推斷該基因功能與湖羊的生殖和發(fā)育相關(guān)，但未有進一步研究。

湖羊作為國家級的綿羊資源保護品種，集生長快、產(chǎn)羔多、羔皮美觀等多個優(yōu)點于一體[25-26]，探究其垂體機能與生殖機制對提高其繁殖力有重要意義。因此，本研究將對HSD17B12基因的CDS區(qū)進行序列擴增，分析其預(yù)測蛋白序列的正確性和物種同源性。并在組織和細胞水平上鑒定HSD17B12在垂體組織中的表達定位，結(jié)合RNA干擾和細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，干擾HSD17B12的表達，進一步分析細胞增殖、凋亡變化，探索其對垂體激素分泌功能的影響，這將為湖羊垂體中HSD17B12的調(diào)控機制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗樣品來自江蘇省泰州市海倫羊業(yè)有限公司，選擇體況健康、體重為40 kg左右的9月齡湖羊公羊3只，取其腦垂體組織進行-80 ℃凍存及4%多聚甲醛固定。選擇健康的3月齡湖羊公羊，取垂體組織進行垂體細胞分離培養(yǎng)。

1.2 HSD17B12基因CDS區(qū)擴增

利用Trizol法提取垂體組織RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。根據(jù)NCBI中已知的綿羊HSD17B12基因預(yù)測序列，針對其CDS區(qū)用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物，見表1，由南京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以湖羊垂體組織cDNA 為模板，普通PCR擴增HSD17B12基因CDS區(qū)，擴增體系：2 × Phanta Max Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1HSD17B12-CDS-F 0.8 μL，10 μmol·L-1HSD17B12-CDS-R 0.8 μL，cDNA 1 μL， Nuclease Free Water 7.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，獲得正確產(chǎn)物大小的片段。并將PCR產(chǎn)物交由南京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。最后，利用DNAMAN 9.0對HSD17B12的CDS序列進行翻譯和同源性分析。

表1 HSD17B12基因克隆引物

1.3 免疫組織化學(xué)分析HSD17B12在垂體組織中的定位

將固定好的垂體組織小塊進行石蠟包埋并進行組織切片，厚度為5 μm。按照切片脫蠟、抗原修復(fù)、通透、5% BSA封閉等步驟依次進行。在濕盒中4 ℃ 過夜孵育HSD17B12一抗(CUSABIO, CSB-PA687494LA01HU)[10]，之后依次進行二抗孵育和DAB顯色，再用蘇木素染料染核，脫水透明，最后封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 湖羊垂體細胞培養(yǎng)及HSD17B12基因轉(zhuǎn)染

本試驗對所采集的3月齡湖羊垂體組織進行垂體細胞分離，分離步驟參照文獻[27]。之后在添加有10%胎牛血清以及1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。根據(jù)HSD17B12基因序列，在上海吉瑪公司進行siRNA 的設(shè)計與合成，見表2。在轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞傳代至6孔板中，待細胞密度達到70%～80%，參照Lipofectamine?3000說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細胞上清，提取細胞總RNA，進行下一步試驗。

表2 HSD17B12基因干擾序列

1.5 干擾HSD17B12基因后對垂體細胞增殖、周期及凋亡的檢測

1.5.1 EdU染色檢測細胞增殖 將細胞接種于鋪有細胞爬片的24孔板，待細胞密度為70%～80%進行轉(zhuǎn)染，24 h后去除培養(yǎng)液，并加入完全培養(yǎng)基稀釋的EdU工作液(40 nmol·L-1)孵育6 h。孵育完成后，去除培養(yǎng)基，DPBS洗2次，4%多聚甲醛固定，室溫孵育20 min，去除固定液。每孔加入500 μL 2 mg·mL-1甘氨酸溶液，室溫孵育5 min后，使用含有3% BSA的PBS洗滌細胞2次，加入500 μL 0.5% Triton X-100到每個孔中，室溫孵育20 min。然后按照試劑盒說明書進行EdU檢測及DNA復(fù)染，最后在顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.5.2 PI單染法檢測細胞周期 細胞轉(zhuǎn)染24 h后，棄上清，DPBS洗3次，0.25%胰酶消化細胞，1 500 r·min-1離心5 min后，棄上清，再洗2次，用75%酒精重懸細胞，-20 ℃固定3 h后用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A, 37 ℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色液混勻，4 ℃避光30 min。用流式細胞儀記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光，最后進行數(shù)據(jù)分析。

1.5.3 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)液，DPBS洗3次，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞，再用PBS洗滌細胞2次并1 500 r·min-1離心5 min；在收集到的細胞中加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞；再加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；接著室溫避光反應(yīng)5～15 min； 用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 干擾HSD17B12基因后垂體細胞RNA提取與熒光定量PCR

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，去上清液，DPBS洗3次，使用Trizol裂解細胞，充分吹打后收集至1.5 mL離心管，按照說明書進行RNA提取和cDNA合成。結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫，利用Primer 5.0軟件進行HSD17B12、FSHβ、LHβ、GH、PCNA基因的引物設(shè)計，并由南京擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見表3。熒光定量PCR(qPCR)體系： SYBR Green Master 10 μL，基因上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.6 μL，cDNA 1 μg，Nuclease Free Water補充至20 μL。將混合好的體系在熒光定量PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序：50 ℃2 min； 95 ℃ 預(yù)變性10 min；依次95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。 反應(yīng)結(jié)束后，通過2-ΔΔCt法，以ACTB基因為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_量進行相對定量分析。

表3 基因PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

本研究所涉及試驗均重復(fù)至少3次，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤(mean±SEM)”表示。用SPSS(24)軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，*與**分別代表差異顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 HSD17B12基因CDS區(qū)合成及蛋白同源性分析

本研究利用PCR擴增了HSD17B12基因的CDS區(qū)序列，PCR產(chǎn)物如圖1所示，進行測序后發(fā)現(xiàn)，其大小為939 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的HSD17B12基因CDS區(qū)一致，未發(fā)生突變。利用DNAMAN進行CDS區(qū)序列翻譯和氨基酸序列同源性比對后發(fā)現(xiàn)，HSD17B12的CDS區(qū)序列可以編碼312個氨基酸(圖2)，與山羊、牛、人、小鼠蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，其蛋白同源性較高，其中跟山羊同源性可高達99%，其次與牛同源性達91%，與人和小鼠同源性分別為84%和80%(圖3)，證明HSD17B12在物種間保守性較高。

A.HSD17B12基因CDS區(qū)擴增的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析；B.HSD17B12基因CDS區(qū)擴增示意圖 A. Gel electrophoresis analysis of PCR product amplified from CDS region of HSD17B12 gene; B. Schematic diagram of CDS region amplification of HSD17B12 gene圖1 HSD17B12基因CDS區(qū)擴增Fig.1 CDS region amplification of HSD17B12 gene

ATG和TGA分別表示起始密碼子和終止密碼子 ATG and TGA represent start codon and stop codon, respectively圖2 HSD17B12基因CDS區(qū)核酸序列及氨基酸預(yù)測序列Fig.2 CDS region nucleotide and predicted amino acid sequences of HSD17B12 gene

2.2 HSD17B12在垂體組織中的表達定位

垂體組織中主要包括嗜酸性、嗜堿性和嫌色性3類腺細胞，參與生長激素、促性腺激素、甲狀腺激素等的分泌。免疫組化結(jié)果顯示，HSD17B12在湖羊垂體組織的大部分區(qū)域均顯著表達(圖4)。

2.3 干擾HSD17B12基因?qū)Υ贵w激素分泌及合成相關(guān)基因的影響

為研究HSD17B12在垂體的作用，本研究設(shè)計合成了HSD17B12的siRNA，并進行干擾試驗。如圖5所示，3種siRNA均可顯著降低HSD17B12基因的表達，但是siRNA-2效果最顯著(P<0.01)。接下來，以siRNA-2進行后續(xù)試驗，如圖6所示，干擾HSD17B12基因后，垂體激素分泌相關(guān)基因FSHβ、LHβ和GH表達顯著降低(P<0.05)。因此，在綿羊垂體細胞水平干擾HSD17B12基因，可有效降低垂體細胞促性腺激素和生長激素的分泌。

對照組為陰性染色，試驗組為HSD17B12陽性染色 The control group is the negative staining group, and the experimental group is the HSD17B12 positive staining group圖4 免疫組化分析HSD17B12在湖羊垂體組織中的定位(400×)Fig.4 The localization of HSD17B12 in Hu sheep pituitary tissue by immunohistochemical analysis (400×)

NC. 陰性對照組；siRNA. siRNA干擾組。qPCR結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示且以NC為對照。*.P<0.05，**.P<0.01，下同 NC. Negative control group; siRNA. RNA interfering group. qPCR results are expressed relative to the NC group as “mean±SEM”. *.P<0.05, **.P<0.01， the same as below圖5 HSD17B12基因的3個siRNAs干擾效率檢測Fig.5 Detection of 3 siRNAs interference efficiency of HSD17B12 gene

2.4 干擾HSD17B12基因?qū)Υ贵w細胞增殖、周期、凋亡的影響

為進一步探究HSD17B12對垂體激素分泌功能的影響機制，對干擾后細胞的增殖、周期和凋亡情況進行檢測。如圖7所示，干擾HSD17B12基因后，垂體細胞增殖效率顯著降低(P<0.05)，干擾組細胞EdU熒光少于對照組(P<0.05)；此外，細胞流式表明,干擾組中處于S期的細胞比率顯著高于對照組，G1期則相反(P<0.05)，而G2期細胞比率無顯著差異。細胞凋亡結(jié)果顯示，干擾組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比率均較對照組多，細胞總凋亡率顯著增加(P<0.05)。因此，在綿羊垂體細胞干擾HSD17B12基因后，可引起細胞增殖下降、細胞周期發(fā)生改變，細胞凋亡發(fā)生，這些可能是引起細胞激素分泌異常的重要因素。

3 討 論

湖羊是我國著名的多羔綿羊品種，而垂體作為下丘腦-垂體-睪丸/卵巢性腺軸中的中樞器官，它與下丘腦和各種下游內(nèi)分泌器官一起嚴格控制著新陳代謝、生長、生殖以及水分平衡等各種生命過程[28]。目前，關(guān)于湖羊垂體中關(guān)鍵基因的研究主要集中在BMP基因家族及SMAD通路[29-32]。前期研究表明，HSD17B12基因作為lncRNA的靶基因，可調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的分泌。因此，本試驗以HSD17B12基因為研究對象，擴增其CDS區(qū)序列，在組織及細胞水平探索其潛在的功能，為湖羊垂體功能機制研究提供基礎(chǔ)。

HSD17B12作為一種多功能酶，可參與脂肪酸鏈的延長代謝[2, 33]，影響多不飽和脂肪酸的合成。因此，HSD17B12作為脂肪合成相關(guān)靶基因可參與山羊乳腺脂質(zhì)和肉雞脂肪組織中相關(guān)基因表達的調(diào)控[34-35]。研究表明，HSD17B12在小鼠體內(nèi)參與了花生四烯酸(AA)的合成，對胚胎的神經(jīng)元發(fā)育造成影響[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSD17B12除了影響AA的產(chǎn)生，還與COX-2共表達，參與到前列腺素的形成過程中[8, 36]，進而影響卵子發(fā)生和排卵調(diào)節(jié)等卵巢功能，最終影響到雌性生殖生理。此外，HSD17B12將E1轉(zhuǎn)化為E2的轉(zhuǎn)化率明顯大于其將4-雄烯二酮轉(zhuǎn)化為睪酮的轉(zhuǎn)化率[1]。這種類固醇激素轉(zhuǎn)化特異性與酶底物結(jié)合域的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。盡管本試驗發(fā)現(xiàn)，HSD17B12在不同物種中蛋白同源性較高，但仍有研究表明，其在不同物種中的作用方式不同[1, 5]。此外，E1轉(zhuǎn)化為E2需要HSD17B12、HSD17B1和HSD17B7共同催化。HSD17B12通過對E2形成細胞特異性調(diào)節(jié)，招募細胞特異性激活/抑制因子，形成特異性復(fù)合物，從而激活或抑制雌激素敏感基因的表達[1]，進而影響哺乳動物生殖活動。

NC. 陰性對照組；siRNA. siRNA干擾組。qPCR結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示且以NC為對照 NC. Negative control group; siRNA. RNA interfering group. qPCR results are expressed relative to the NC group as “mean±SEM”圖6 干擾HSD17B12基因后增殖標記基因PCNA和激素相關(guān)基因表達的變化Fig.6 Changes of the expression levels of proliferation marker gene PCNA and hormone-related genes after interfering HSD17B12 gene interference

A. EdU檢測干擾HSD17B12后細胞增殖變化；B. 細胞流式分析干擾HSD17B12后垂體細胞周期變化；C. 細胞流式分析干擾HSD17B12對垂體細胞凋亡的影響。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示且以NC為對照 A. Cell proliferation change is detected after interfering HSD17B12 gene by EdU analysis; B. Cells cycle detection is analyzed after interfering HSD17B12 gene by flow cytometer; C. Pituitary cell apoptosis is detected after interfering HSD17B12 gene by flow cytometer. The results are expressed relative to the NC group as “mean±SEM”圖7 干擾HSD17B12基因?qū)d羊垂體細胞增殖、周期、凋亡的影響Fig.7 The effect of HSD17B12 gene interference on sheep pituitary cell proliferation, cycle and apoptosis

垂體可根據(jù)組織結(jié)構(gòu)分為神經(jīng)垂體和腺垂體，而腺垂體大部分位于垂體前葉[18]，在內(nèi)分泌過程中起到至關(guān)重要的作用。腺垂體遠側(cè)部會分泌促性腺激素(FSH和LH等)來影響類固醇激素的產(chǎn)生，從而影響整個生殖系統(tǒng)的發(fā)育。有研究表明，F(xiàn)SH和LH的比例一定程度上會影響生殖器官的發(fā)育，例如高FSH/LH會造成卵巢發(fā)育不良[37]。在下丘腦-垂體-性腺軸中，垂體感受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)后，相應(yīng)增加或減少FSH和LH的分泌，從而影響性激素如雌二醇、孕激素含量的變化。而最終分泌的性激素又可以通過負反饋調(diào)節(jié)靶向作用于垂體，進一步影響垂體促性腺激素的分泌。研究表明，HSD17B12與類固醇激素的產(chǎn)生存在聯(lián)系，推測其在垂體的表達可能與垂體激素合成相關(guān)基因以及它們對性腺激素等類固醇激素的作用有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)育不同階段，不同劑量的雌激素可以以不同的方式調(diào)節(jié)下丘腦垂體的基因表達[38]。而一定量的雌激素可以誘導(dǎo)垂體催乳素的分泌[39]。本研究中蛋白定位結(jié)果說明，HSD17B12在湖羊垂體組織大部分細胞中均表達，且之前研究也表明，其在下丘腦、垂體中表達量最高，這些結(jié)果暗示，HSD17B12基因在垂體中具有重要作用。體外干擾試驗也說明，下調(diào)HSD17B12基因的表達造成垂體細胞中FSHβ、LHβ和GH的表達水平顯著降低。同時，細胞增殖也下降，周期發(fā)生改變，凋亡率增加，這些因素有可能是造成激素相關(guān)基因表達水平顯著下降的原因。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中沉默HSD17B12基因的表達，導(dǎo)致細胞生長受到抑制，凋亡增加[7]，在乳腺癌細胞中敲低HSD17B12基因的表達會降低細胞增殖效率[9]。這些與本研究結(jié)果相一致。但是在牛乳腺上皮細胞的研究中，HSD17B12基因的過表達會抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡[40]。這些結(jié)果表明，在不同的物種或細胞中，HSD17B12的作用效果不盡相同，但都是通過與花生四烯酸相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮功能。因此，本研究可在后續(xù)試驗中，探索花生四烯酸在HSD17B12調(diào)節(jié)垂體激素分泌過程中的作用機制。

總體來說，本試驗以湖羊垂體組織和細胞為研究對象，確定了HSD17B12基因的CDS區(qū)序列為939 bp，并對其在湖羊垂體中的表達進行定位分析，此外，在細胞水平上證明其可通過介導(dǎo)細胞增殖、周期和凋亡的改變而影響垂體細胞激素相關(guān)基因的表達，但其作用機制仍需要進一步探討。本研究對HSD17B12基因在湖羊垂體中的功能進行了初步驗證，為其作用機制研究的深入探索奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

綜上表明，HSD17B12序列在物種間呈現(xiàn)較高的保守性，且在雄性湖羊垂體組織的大部分區(qū)域均有表達。在垂體細胞干擾HSD17B12的表達會顯著降低促性腺激素相關(guān)基因和生長激素基因的表達，同時可以顯著降低細胞增殖效率，改變細胞周期，提高細胞凋亡率。因此，體外干擾HSD17B12的表達會通過影響細胞的凋亡與增殖而影響細胞激素的分泌，為探究垂體促性腺激素合成分泌的機理提供理論基礎(chǔ)。