戴 巍，宋瑞龍，張遠(yuǎn)浩，鄒 輝， 顧建紅，袁 燕，卞建春，劉學(xué)忠*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009； 2. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚(yáng)州 225009； 3. 揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cell，MSC)又稱為肌源性干細(xì)胞，位于肌纖維肌膜和周圍細(xì)胞外基質(zhì)之間，即基底膜(ECM)處[1]。細(xì)胞呈扁平紡錘形或梭形，在正常條件下，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止的待激活狀態(tài)，當(dāng)受到外界各類刺激后被激活，修復(fù)損傷。因此，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)骨骼肌再生和生長起著至關(guān)重要的作用。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞起源尚不完全清楚，目前有兩種假說：第一種為體節(jié)來源假說，即衛(wèi)星細(xì)胞起源于胚層內(nèi)體節(jié)來源的細(xì)胞中，這種假說被證實(shí)于鵪鶉胚胎試驗(yàn)[2]；第二種為非生肌來源假說，De Angelis等[3]將分離胚胎背部主動(dòng)脈得到的細(xì)胞移植到小鼠中，可參與肌肉再生。但成熟骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)出兩種標(biāo)記物, 且骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞存在異質(zhì)性，表明兩種起源可能都是存在的[4]。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞移植作為一種治療多種再生性疾病(肌營養(yǎng)不良、心力衰竭等)的手段，目前已被廣泛研究[5]。因此，高純度骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為移植細(xì)胞及基因治療工程細(xì)胞在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。然而，由于其干細(xì)胞的特性，MSC含量?jī)H占總肌細(xì)胞的2%～5%，且目前，MSC分離純化往往需要使用細(xì)胞分選儀，操作復(fù)雜且代價(jià)較高[6]，實(shí)驗(yàn)室分離方法一般為組織貼壁法和單雙酶解法，但其耗時(shí)長、細(xì)胞存活率低、保存性差。因此，建立一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、高效的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法尤為重要。鑒于此，本試驗(yàn)在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上對(duì)提取細(xì)胞使用的酶、純化細(xì)胞的方法以及后續(xù)的細(xì)胞分化方法進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一種高效的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

12胚齡SPF雞胚來自濟(jì)南鑫盛達(dá)生物工程有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM-F12高糖培養(yǎng)基(Gbico)；胎牛血清(Gbico)；青鏈霉素混合液(10 000 mg·L-1青霉素、10 000 mg·L-1鏈霉素，索萊寶)；磷酸鹽緩沖液PBS(自配)；自制混合酶溶液(胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶；專利號(hào)：201911226803.8)；0.25%胰蛋白酶(新賽美)；CCK-8試劑(上海同仁)；4%多聚甲醛(新賽美)；Pax7抗體、Desmin抗體(ABclonal)；兔抗鼠488標(biāo)記二抗、DIPI(碧云天)；TRIzol試劑(天根)；反轉(zhuǎn)錄試劑、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)。其他試劑均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純。所有PCR引物均由華大基因有限公司合成。

5810RR型冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；WYJ-857BR型醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州金燕凈化設(shè)備廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；Sunrise-basic型酶標(biāo)儀(Tecan)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.3 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取12胚齡SPF雞蛋，取出雞胚；酒精棉擦拭腿部。取髖關(guān)節(jié)以下腿部，棄筋膜、脂肪、骨骼等非肌肉組織，并用PBS緩沖液沖洗；用眼科剪剪至肉糜狀，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打混勻，靜置5 min，棄上清；加入組織塊兩倍體積的自制混合酶溶液(專利號(hào)：201911226803.8)，置37 ℃恒溫?fù)u床中消化30 min； 待消化完畢后加入同等體積生長培養(yǎng)基(含15% FBS，1%青鏈霉素混合液的F12-DMEM培養(yǎng)基)終止消化。消化液依次過100目和400目細(xì)胞過濾篩。細(xì)胞懸液1 500 r·min-1離心10 min；棄上清，生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.4 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞純化及傳代培養(yǎng)

細(xì)胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸并移入培養(yǎng)板中，置37 ℃培養(yǎng)箱1 h；取未貼壁細(xì)胞懸液移入新的培養(yǎng)板中進(jìn)行第二次貼壁，以此去除成纖維細(xì)胞；24～36 h后換液，從而完成對(duì)傳統(tǒng)差速貼壁法的優(yōu)化。

由于MSC密度達(dá)到70%后會(huì)出現(xiàn)融合，因此，在密度達(dá)到60%左右便可以進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)基并用PBS洗兩遍，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶；培養(yǎng)基終止消化；收集細(xì)胞懸液，1 500 r·min-1離心5 min；重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，滴管吹落細(xì)胞，1 500 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，凍存液重懸后置液氮中保存。

1.5 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化

取培養(yǎng)至第二代的細(xì)胞，待其分裂生長至70%且開始融合后，棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含4% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基)，誘導(dǎo)分化2～3 d，鏡下觀察MSC分化情況。

1.6 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長曲線的繪制

取第三代細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞；分為7組，每組5個(gè)重復(fù)。接種時(shí)間記為第0天，之后連續(xù)7 d在固定的時(shí)間提前1 h加入10 μL CCK-8，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.7 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光鑒定

取第三代細(xì)胞接種于24孔板上，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞用PBS洗滌；4%多聚甲醛固定20 min， 0.2%～0.5% Triton X-100透膜處理15 min； 處理完畢后用PBS洗滌；滴加5% BSA封閉1～2 h；棄封閉液，分別加入Pax7、Desmin一抗，4 ℃過夜孵育；回收一抗，PBS洗滌；加入相應(yīng)的兔抗鼠488標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌；加入DIPI染核15 min；PBS洗滌；封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞RT-PCR鑒定

取第四代細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用Trizol 法進(jìn)行總RNA的提取，試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA； 以cDNA為模板，加入Pax7、MyHC、MyoD1基因上、下游引物進(jìn)行RT-PCR，引物序列見表1；20 μL體系：10 μL SYBR MIX，上、下游引物各0.4 μL, 2 μL cDNA，無酶水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外成像系統(tǒng)采集圖像。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，組間差異性采用SPSS 17.0軟件中兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)觀察

用優(yōu)化后的差速貼壁法純化細(xì)胞，經(jīng)過24 h后細(xì)胞貼壁，圖1A中細(xì)胞生長旺盛、排列整齊、雜質(zhì)較少；圖1B中細(xì)胞接觸生長相互連接；圖1C中細(xì)胞在分化前呈梭形。

細(xì)胞生長到70%趨于融合時(shí)，誘導(dǎo)分化。由圖2可見，誘導(dǎo)分化12 h時(shí)細(xì)胞匯集成簇(圖2A)；24 h 時(shí)形成肌管(圖2B)；48 h時(shí)肌管粗大、排列整齊(圖2C)。

A.4倍鏡下細(xì)胞形態(tài)；B.10倍鏡下細(xì)胞形態(tài)；C.20倍鏡下細(xì)胞形態(tài) A. Cell morphology under ×4 microscope; B. Cell morphology under ×10 microscope; C. Cell morphology under ×20 microscope圖1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology under microscope

A.誘導(dǎo)分化12 h；B.誘導(dǎo)分化24 h；C.誘導(dǎo)分化48 h A. Induced differentiation for 12 h; B. Induced differentiation for 24 h; C. Induced differentiation for 48 h圖2 誘導(dǎo)分化后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(40×)Fig.2 Cell morphology under microscope after induced differentiation(40×)

2.2 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長曲線及存活率

由圖3可見，第三代的MSC生長曲線呈“S”型。其中，第1～3天為潛伏期，細(xì)胞增殖緩慢，第3～5天 為對(duì)數(shù)增長期，第5天細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大，第5～6天 細(xì)胞生長進(jìn)入平臺(tái)期，第6天以后，細(xì)胞數(shù)量減少。說明雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下能夠存活、增殖，且生長狀況良好。

將所得雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)算，由表2可見，(90.82±1.294)%的細(xì)胞不著色，提示優(yōu)化改良后的方法所得的細(xì)胞存活率較高。

2.3 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光鑒定

采用免疫熒光對(duì)MSC特異性標(biāo)志基因Pax7、Desmin的表達(dá)進(jìn)行鑒定，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。由圖4可見，Pax7抗體與細(xì)胞中蛋白結(jié)合良好(圖4B)，蛋白處于細(xì)胞核中，符合衛(wèi)星細(xì)胞特性(圖4C)。由圖5可見，Desmin抗體與細(xì)胞中蛋白結(jié)合良好(圖5B)，蛋白處于細(xì)胞質(zhì)中，符合衛(wèi)星細(xì)胞特性(圖5C)。

隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)照核染位置及明場(chǎng)，計(jì)算陽性率，得出其純度可達(dá)(90.44±1.264)%。

圖3 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長曲線Fig.3 Growth curve of chicken skeletal muscle satellite cells

表2 細(xì)胞活率

圖4 Pax7免疫熒光染色鑒定(20×)Fig.4 Pax7 immunofluorescence staining identification (20×)

圖5 Desmin免疫熒光染色鑒定(20×)Fig.5 Desmin immunofluorescence staining identification (20×)

2.4 雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞RT-PCR鑒定

采用RT-PCR以及凝膠電泳檢測(cè)純化后MSC靜止期、分化期、增殖期的標(biāo)志性基因Pax7、MyHC、MyoD1的表達(dá)量。結(jié)果如圖6顯示，Pax7、MyHC、MyoD1表達(dá)陽性；由圖7可見，分化后靜止期標(biāo)志性基因Pax7表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，比分化前降低了1.705倍；分化后標(biāo)志性基因MyHC表達(dá)量極顯著上升(P<0.01),是分化前的13.073倍。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) M.DNA marker圖6 Pax7、MyHC、MyoD1凝膠電泳鑒定Fig.6 Gel electrophoresis to identify Pax7, MyHC, MyoD1

*.P<0.05；**.P<0.01圖7 分化前后Pax7、MyHC基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Pax7 and MyHC gene transcription levels before and after differentiation

3 討 論

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為一種肌源質(zhì)干細(xì)胞，在機(jī)體正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到一定的刺激時(shí)，可瞬時(shí)活化進(jìn)入細(xì)胞周期完成修復(fù)，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有非常重要的作用。長期以來，MSC都被認(rèn)為是只能分化為肌管的單潛能干細(xì)胞；但近些年的研究結(jié)果表明，MSC也具備多潛能分化能力[7-8]。Ruiz-ojeda等[9]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加胰島素、地塞米松和羅格列酮等誘導(dǎo)因子后，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化并產(chǎn)生大量脂滴；而添加β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松則可以促進(jìn)鈣質(zhì)形成，從而誘導(dǎo)MSC向成骨分化[10]。這些研究表明，MSC具有可塑性強(qiáng)、多潛能等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于損傷修復(fù)以及基礎(chǔ)研究中。而高效、便捷的分離方法便成為了后續(xù)研究的基礎(chǔ)，因此，近年來分離純化的方法在不斷改進(jìn)。

常用分離的方法一般為組織貼壁法[11-12]、兩步消化法[13]和單酶解法[14]。最傳統(tǒng)的為組織貼壁法，但其需要的時(shí)間很長，已逐漸被淘汰；兩步消化法常用膠原酶或分散酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化，但其耗時(shí)長，過程中易污染；單酶解法常只用膠原酶消化，容易消化不完全。且目前，成功分離的MSC以人、鼠、豬為主，在禽類中尚沒有很好的分離方法。本試驗(yàn)采用自主研制的混合酶，綜合了膠原酶松散肌肉纖維及胰蛋白酶游離細(xì)胞的原理，通過比例篩選，擇出消化效果最優(yōu)、成本最低的配方，最終一步消化完成MSC分離，從而縮短分離時(shí)間，最大限度地解決了現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞活率低、數(shù)量少、可保存性差的缺陷和不足。但是，酶消化法分離細(xì)胞不可避免地會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞混雜其中，因此，為了提高M(jìn)SC的純度，必須進(jìn)行純化。其中，最高效的方法是采用高通量細(xì)胞分選儀器進(jìn)行精密的分選純化[6]，但需要昂貴的儀器，且分選前還要進(jìn)行繁瑣的細(xì)胞標(biāo)記處理，因此并不適用于家禽MSC的純化；梯度離心法由于其操作復(fù)雜且MSC本身數(shù)量較少，會(huì)使細(xì)胞在純化過程進(jìn)一步流失；而傳統(tǒng)差速貼壁法則根據(jù)MSC首次貼壁需要12～24 h這一特性，一般需要進(jìn)行兩次2 h和一次24 h的兩次更換培養(yǎng)皿[15]。該方法耗時(shí)較長，因此，本試驗(yàn)根據(jù)成纖維細(xì)胞在0.5～1 h就能貼壁這一特性，在傳統(tǒng)差速貼壁法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，也就是每隔1 h將上清轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，連續(xù)重復(fù)2～3次，這一改進(jìn)大大減少了純化細(xì)胞的時(shí)間和工作量，且純化效果良好。本試驗(yàn)根據(jù)MSC生長到70%開始融合，并且在外界刺激條件下會(huì)定向分化為肌管這一特性，模擬非適宜的生長環(huán)境，通過多次FBS濃度的篩選，開創(chuàng)性地采用低血清濃度分化法，也就是當(dāng)MSC生長到70%左右時(shí)采用含4% FBS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化MSC，取代了傳統(tǒng)的含2%的馬血清與1%～2%雞胚提取物制成的分化培養(yǎng)基，在保證細(xì)胞活率的情況下，更加簡(jiǎn)便快捷，提高了在普通實(shí)驗(yàn)室操作的可行性。

目前，對(duì)MSC的鑒定公認(rèn)度最高的是免疫熒光標(biāo)記法，而Pax7是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞靜止期的特異性標(biāo)志蛋白，可以作為鑒定細(xì)胞的標(biāo)志物[16]；Desmin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的成分之一，為肌纖維所特有，是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的基本標(biāo)記[17]。因此，本試驗(yàn)采用Pax7、Desmin雙染，從而初步鑒定分離的細(xì)胞為具有分化潛能的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。同時(shí)，采用RT-PCR的方法檢測(cè)靜止期、增殖期及分化期特異性基因Pax7、MyoD1、MyHC的表達(dá)量，進(jìn)一步證明本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞是具有多潛能分化生物學(xué)特性的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用自制混合酶初步建立了雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離方法，并對(duì)細(xì)胞純化和誘導(dǎo)方法進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)，在形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)水平上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。為雞骨骼肌生長發(fā)育、肉質(zhì)改良、藥理毒理試驗(yàn)、細(xì)胞移植及基因治療工程在臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。