方 晨，郭 飛，胡瑞舉，楊明華，張 斌，劉韶娜，黃 英，趙彥光*，趙素梅*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201； 2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明650224)

斷奶仔豬腹瀉是由多種因素引起的急性、致死性傳染病。腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)F18通過(guò)黏附于仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞的受體蛋白釋放腸毒素，引起仔豬斷奶前后腹瀉和水腫[1-2]。α(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1(α-1，2-fucosyltransferase gene，F(xiàn)UT1)是調(diào)節(jié)大腸桿菌F18黏附受體表達(dá)的一個(gè)候選基因[3]，位于豬6號(hào)染色體的6q11 區(qū)段，與仔豬的腹瀉和水腫有關(guān)[4-6]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)UT1基因與豬的腹瀉、產(chǎn)仔性能、發(fā)育性狀等相關(guān)[7-14]。

雜交技術(shù)作為豬育種的重要手段之一，不僅集合多個(gè)豬品種的優(yōu)勢(shì)，還可以產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，提高品種的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。二元雜交指利用兩個(gè)品種或品系的公母豬進(jìn)行雜交，簡(jiǎn)單易行，又稱為簡(jiǎn)單雜交[15]。外來(lái)豬種具有瘦肉率高、生長(zhǎng)快、屠宰率高等特點(diǎn)，地方豬種在長(zhǎng)期馴養(yǎng)中已適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境，具有繁殖力高、抗病力及抗逆性強(qiáng)、耐粗飼、遺傳力穩(wěn)定、雜交優(yōu)勢(shì)明顯等優(yōu)勢(shì)特征[16]。迪慶藏豬、滇南小耳豬是云南省優(yōu)良的地方品種，迪慶藏豬多位于高原嚴(yán)寒地區(qū)，滇南小耳豬多生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶高溫潮濕地區(qū)，均具有抗逆性強(qiáng)、肉品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。二元豬有明顯的雜交優(yōu)勢(shì)，生長(zhǎng)速度快，育肥效果好[19]。杜滇豬、杜藏豬是以國(guó)外引進(jìn)豬種杜洛克豬為父本，分別以地方豬種滇南小耳豬、迪慶藏豬為母本進(jìn)行雜交組合獲得的二元雜交豬。以地方豬為核心的配套系生產(chǎn)模式既能改善地方豬生產(chǎn)性能偏低的問(wèn)題，又能有效地保護(hù)珍稀地方豬種遺傳資源，保留地方豬優(yōu)良特性，是兼顧市場(chǎng)與遺傳資源保護(hù)的重要舉措[20]。

標(biāo)記輔助選擇法(marker-assisted selection，MAS)為豬抗病性狀的選育提供了一種新的方法，利用影響抗病性能的主效基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種是提高抗病力性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑[21]。本試驗(yàn)以杜滇、杜藏和杜洛克斷奶仔豬為研究對(duì)象，通過(guò)研究FUT1基因多態(tài)性與斷奶仔豬腹瀉的關(guān)系，探究與抗病育種相關(guān)的候選基因和遺傳標(biāo)記，為選育優(yōu)良的抗病豬種提供一定的理論依據(jù)，減少抗生素在臨床上的使用并有效控制病發(fā)率，提高仔豬成活率，增加養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)在云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)豬與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所豬場(chǎng)進(jìn)行，選擇35日齡8 kg左右體重的斷奶仔豬365頭，其中杜藏豬(杜洛克豬♂×迪慶藏豬♀)113頭、杜滇豬(杜洛克豬♂×滇南小耳豬♀)165頭、杜洛克豬(杜洛克豬♂×杜洛克豬♀)87頭。

1.2 試驗(yàn)日糧及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)日糧配方參照中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，日常飼養(yǎng)管理及試驗(yàn)步驟均按照動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與使用指南》執(zhí)行。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)豬出生后1 d內(nèi)采集耳組織，并放入裝有酒精的2 mL離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.4 腹瀉統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)期為14 d，每天觀察斷奶仔豬腹瀉情況，記錄腹瀉頭數(shù)，統(tǒng)計(jì)輕、中、重度腹瀉率、總腹瀉率和腹瀉指數(shù)。

根據(jù)糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記錄腹瀉情況：正常情況，糞便干燥記0分；輕度腹瀉，軟糞且呈形記1分；中度腹瀉，糞便液樣呈灰色或黃色記2分；重度腹瀉，糞便水樣呈噴射狀記3分。

腹瀉率的計(jì)算：腹瀉率=試驗(yàn)期腹瀉仔豬頭次/(試驗(yàn)仔豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100%；腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)(稀便率為每只斷奶仔豬所排的稀便數(shù)與總便數(shù)之比。稀便級(jí)表示每只斷奶仔豬稀便的程度)。

1.5 基因組DNA提取

參照試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行DNA的提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定基因組DNA濃度，并稀釋到50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)豬FUT1基因的全序列(GenBank登錄號(hào)：NC_010448.4)，用Primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物(表1)，設(shè)計(jì)的引物由Invitrogen公司合成。

表1 FUT1基因分段擴(kuò)增引物

1.7 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL：Template(10×)2 μL， 上、下引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Taq PCR Master Mix(10 mmol·L-1)12.5 μL(擎科生物有限公司)，ddH2O 3.5 μL。PCR產(chǎn)物由通用生物公司測(cè)序，F(xiàn)UT1基因PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2. 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。FUT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰明亮，與預(yù)期片段大小相符，符合DNA 測(cè)序的要求(圖1)。

2.2 FUT1多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)及基因型判定

將6段測(cè)序序列拼接，得到FUT1基因全長(zhǎng)3 045 bp。 將測(cè)序結(jié)果與豬FUT1基因全序列比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn)，3個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變。其中，第一外顯子18 bp處堿基T→C(T18C)，存在CT和TT 2種基因型；第二外顯子中，229 bp堿基C→T(C229T)，亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?，有CC、CT和TT 3種基因型；2 418 bp堿基C→A(C2418A)，亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔瑸镃C、CA 2種基因型；306 bp堿基A→G(A306G)，蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，有AA、AG和GG 3種基因型。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A、B、C、D、E、F. FUT1-1、2、3、4、5、6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 M.D2000 Marker; A, B, C, D, E, F. PCR amplification products of FUT1-1, 2, 3, 4, 5 and 6, respectively圖1 FUT1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification products of FUT1 gene

2.3 FUT1基因型頻率和等位基因頻率分析

多態(tài)性和雜合度方面，4個(gè)突變位點(diǎn)均為中度。χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，除T18C位點(diǎn)、杜藏豬的C2418A位點(diǎn)外，其他突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。T18C位點(diǎn)處，杜藏豬、杜滇豬CT基因型頻率最高，杜洛克豬TT型最高；C229T位點(diǎn)上，杜藏豬和杜滇豬均以TT為主要基因型，杜洛克豬以CT為主要基因型；杜藏豬C2418A位點(diǎn)的AC和CC基因型頻率相同，杜滇豬和杜洛克豬CC基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；A306G位點(diǎn)與C229T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率數(shù)值一致，可能存在遺傳關(guān)聯(lián)反應(yīng)(表2)。

2.4 FUT1突變位點(diǎn)基因型與腹瀉率關(guān)聯(lián)性分析

T18C位點(diǎn)中，杜滇豬、杜藏豬TT基因型的各項(xiàng)腹瀉指標(biāo)(除杜藏豬的輕度腹瀉率外)均高于CT型，但杜洛克豬CT型的各項(xiàng)腹瀉指標(biāo)均高于TT型，其中的總腹瀉率差異極顯著(P<0.01)；C229T位點(diǎn)處，除了杜滇豬的重度腹瀉率，其他豬CC型的腹瀉指標(biāo)均高于CT、TT型，其中的總腹瀉率呈顯著差異(P<0.05)；在C2418A位點(diǎn)，除杜滇豬外，其余兩種豬AC型的腹瀉指標(biāo)均高于CC型，杜洛克豬部分指標(biāo)為差異極顯著(P<0.01)；A306G位點(diǎn)與C229T位點(diǎn)的腹瀉指標(biāo)結(jié)果相同，可能存在關(guān)聯(lián)反應(yīng)(表3)。

3 討 論

遺傳和環(huán)境兩大因素會(huì)共同導(dǎo)致動(dòng)物疾病的發(fā)生[22]。個(gè)體對(duì)環(huán)境中致病因子易感性(或抗性)的遺傳基礎(chǔ)為基因組結(jié)構(gòu)差異或者其表達(dá)水平的差異[23]。羅艷茹[24]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白、大白和松遼黑豬在FUT1基因第307位均存在多態(tài)，檢測(cè)到GG、AG和AA 3種基因型，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，且3種基因型之間存在差異。朱弘焱等[25]研究發(fā)現(xiàn)，荷包豬、長(zhǎng)白豬、大白豬、大長(zhǎng)雜交豬的FUT1 基因型分布趨勢(shì)為AA

表2 杜藏豬、杜滇豬和杜洛克豬FUT1基因SNP位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率

表3 FUT1基因多態(tài)性位點(diǎn)各基因型的腹瀉率結(jié)果

斷奶仔豬易患腹瀉和水腫病，是引起斷奶仔豬死亡的重要病因[26]。豬腸毒素型大腸桿菌引起的仔豬腹瀉和水腫病是由于大腸桿菌F18的兩個(gè)亞基黏附在其小腸黏膜上皮細(xì)胞上并產(chǎn)生腸毒素而引起的[27-30]。吳圣龍等[31-32]證實(shí)，F(xiàn)UT1基因的M307位點(diǎn)多態(tài)性與斷奶仔豬腹瀉和水腫病存在直接的相關(guān)性，且抗病性AA基因型不僅對(duì)斷奶仔豬腹瀉具有抗性，且具有較高的一般抗病性。FUT1基因第307 bp的堿基G突變?yōu)锳，發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物第103位氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，使該酶活性發(fā)生改變，抑制ETEC F18黏附仔豬小腸，因此FUT1基因AA基因型的豬能抵抗ETEC F18感染，AG和GG基因型的豬則易感。周利華等[33]通過(guò)對(duì)10個(gè)國(guó)內(nèi)外豬種FUT1基因新cSNPs的鑒別以及仔豬抗大腸桿菌F18侵染研究，發(fā)現(xiàn) M229C/T和M714T/C兩個(gè)位點(diǎn)，M714位點(diǎn)為同義突變，M229位點(diǎn)引起亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?，F(xiàn)UT1基因M229位點(diǎn)可能是決定中國(guó)地方豬水腫與腹瀉病的變異位點(diǎn)，這與本研究結(jié)果一致。除了C229T突變位點(diǎn)外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了T18C、C2418A、A306G 3個(gè)新突變位點(diǎn)，可能是影響豬抗腹瀉病的關(guān)鍵位點(diǎn)。C2418A、A306G也引起氨基酸變化，可能會(huì)造成FUT1酶活性改變，進(jìn)而控制豬腸毒素大腸桿菌F18對(duì)仔豬小腸的黏附。T18C、C229T、C2418A、A306G位點(diǎn)作為標(biāo)識(shí)斷奶仔豬腹瀉的分子標(biāo)記需進(jìn)一步深入研究。

FUT1基因?qū)嗄特i腹瀉的影響程度因品種或品系的不同而有所差異[34-40]。杜滇豬、杜藏豬作為雜交豬，其T18C位點(diǎn)的中、重度腹瀉率均值，C229T和A306G位點(diǎn)的腹瀉指數(shù)均值以及C2418A位點(diǎn)的重度腹瀉率均值均低于外來(lái)豬種杜洛克豬，呈現(xiàn)一定的雜種優(yōu)勢(shì)和較好的抗病力。通過(guò)研究3種斷奶仔豬FUT1基因多態(tài)性與腹瀉的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其FUT1基因SNP位點(diǎn)的不同基因型對(duì)腹瀉的影響存在差異。T18C位點(diǎn)TT基因型的杜滇和杜藏雜交豬、C229T位點(diǎn)的CC基因型、C2418A位點(diǎn)的CA基因型和A306G的GG基因型的3種豬腹瀉程度相對(duì)較嚴(yán)重，對(duì) ETEC F18敏感，呈顯性遺傳，其他基因型表現(xiàn)為抗性，呈隱性遺傳。后期可在育種時(shí)關(guān)注抗性基因型個(gè)體的引入，期望提高該品系仔豬抗腹瀉病的性能。

4 結(jié) 論

品種和FUT1基因多態(tài)性對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響有一定的差異性和相關(guān)性。地方雜交組合杜滇豬、杜藏豬和杜洛克豬FUT1基因存在4個(gè)突變位點(diǎn)，均處于中度多態(tài)和雜合度，遺傳變異較為豐富。突變位點(diǎn)中3個(gè)為錯(cuò)義突變，可能是決定豬群抗腹瀉病的關(guān)鍵位點(diǎn)，后續(xù)可繼續(xù)深入研究其相關(guān)編碼蛋白結(jié)構(gòu)功能，為分子抗病育種提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。