丁 園，熊 濤

(湖北省漢川市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科, 湖北 孝感 431600)

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)為一種后天獲得性造血干細(xì)胞基因突變的溶血性疾病，患者磷脂酰肌醇糖苷-A(phosphatidylinositol glycanclass-A,PIG-A)基因突變，導(dǎo)致糖肌醇磷脂(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨合成障礙，繼而誘發(fā)一系列由錨缺失引起的細(xì)胞功能變化[1]。PNH臨床表現(xiàn)主要為貧血、血紅蛋白尿、感染等，與再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)臨床表現(xiàn)相似，臨床誤診或漏診并不少見[2]。近年，利用單克隆抗體技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面分化抗原CD55、CD59，成為診斷PNH的重要手段，較傳統(tǒng)溶血試驗(yàn)更具敏感性[3]。外國(guó)學(xué)者也指出，PNH患者不僅存在CD55、CD59缺失，其中性粒細(xì)胞表面還可見CD67、CD24缺失，CD67、CD24表達(dá)水平也能輔助診斷PNH[4]?；诖耍狙芯烤蚉NH、AA及對(duì)照組患者中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平展開分析，并評(píng)估上述分化抗原對(duì)PNH的診斷價(jià)值，為PNH診療提供參考依據(jù)，如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2018年2月至2019年12月我院32例PNH患者(PNH組)臨床資料，并收集同期入院治療的28例AA患者(AA組)及32例健康體檢者(對(duì)照組)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：PNH及AA均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)；AA患者不合并PNH；年齡>18歲；相關(guān)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組排除體檢前3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)感染、輸血等情況者。

1.2方法:采用熒光免疫標(biāo)記法檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面分化抗原CD67、CD24、CD55、CD59：采集清晨空腹外周靜脈血，取100μL全血置于管中，1號(hào)管加入20μL同型對(duì)照(藻紅蛋白標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體)，2號(hào)管加入20μL熒光抗體CD67；室溫避光30min，在5根試管中分別加入2mL溶血素，避光10min；溶血后，離心1000r/min，5min，棄去上清液；使用2mL磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，再懸于0.5mL磷酸緩沖鹽溶液中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)BD公司，型號(hào)：FACS Calibur)，以細(xì)胞物理參數(shù)前向、側(cè)向散射光的點(diǎn)狀圖設(shè)門，確定中性粒細(xì)胞細(xì)胞群，以同型抗體為陰性對(duì)照；使用上述相同的步驟檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面CD24、CD55、CD59表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.13組基線資料比較:3組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙史、飲酒史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組基線資料比較

2.23組中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平比較:3組中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平比較，均為PNH組

表2 3組中性粒細(xì)胞表面CD67 CD24 CD55 CD59表達(dá)水平比較

2.3PNH組中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平的相關(guān)性分析:經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PNH組中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 PNH組中性粒細(xì)胞表面CD67 CD24 CD55 CD59表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.4中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59及其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PNH診斷價(jià)值分析:經(jīng)ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59表達(dá)水平均對(duì)PNH具有較高診斷價(jià)值(AUC=0.961、0.967、0.972、0.995，P<0.05)，其cut-off值分別為81.88%、83.64%、84.42%、81.37%，且4項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷價(jià)值最高(AUC=1.000，P<0.05)，見表4、圖1。

表4 中性粒細(xì)胞表面CD67 CD24 CD55 CD59及其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PNH診斷價(jià)值分析

圖1 中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59及其聯(lián)合檢測(cè)診斷PNH的ROC曲線分析

3 討 論

目前，PNH異?？寺≡鲋成形搓U明，可與免疫機(jī)制、抗凋亡機(jī)制、微環(huán)境改變等相關(guān)，但PNH細(xì)胞PIG-A基因突變引起的GPI錨鏈膜蛋白缺失，引起的血管內(nèi)溶血機(jī)制已得到廣泛認(rèn)可[6]。學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為[7,8]，PNH發(fā)生發(fā)展過程中，最先累及中性粒細(xì)胞，其表面GPI錨鏈膜蛋白缺失可最早被檢出，其中衰變加速因子CD55及反應(yīng)性溶血膜抑制物CD59是臨床最常研究的GPI錨鏈膜蛋白；細(xì)胞表面CD55、CD59表達(dá)缺失，導(dǎo)致細(xì)胞膜上缺乏抑制自身補(bǔ)體活性的物質(zhì)，PNH細(xì)胞對(duì)自身補(bǔ)體異常敏感，遭到補(bǔ)體復(fù)合物攻擊，出現(xiàn)細(xì)胞破壞、消滅，而引起血管內(nèi)溶血、血管栓塞等表現(xiàn)。因此，臨床也常通過檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面CD55、CD59缺失情況，診斷PNH[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，3組中性粒細(xì)胞表面CD55、CD59表達(dá)水平比較，均為PNH組

除上述CD55、CD59外，CD67、CD24也是中性粒細(xì)胞表面GPI錨鏈膜蛋白，早在上世紀(jì)初，就有外國(guó)學(xué)者指出[12]，PNH患者血漿CD67、CD24呈低水平，中性粒細(xì)胞表面存在CD67、CD24缺失。然而后續(xù)相關(guān)報(bào)道較少，大部分研究集中于CD55、CD59與PNH的關(guān)系。本研究就中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24表達(dá)情況與PNH的關(guān)系展開分析，也發(fā)現(xiàn)3組中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24表達(dá)水平比較，均為PNH組

綜上所述，PNH及AA患者中性粒細(xì)胞表面CD67、CD24、CD55、CD59均存在不同程度缺失，PNH缺失程度更為顯著，可作為診斷依據(jù)，輔助臨床判斷。