姜明宇，任明永，高 瑩，吳 楠，于忠瑩

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 哈爾濱 150001)

先天性脊柱裂的發(fā)病與機體的細胞過度凋亡存在著密切的關(guān)系[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)移植可以修復先天性脊柱裂多種組織發(fā)育異常，不僅可以修復各種神經(jīng)元發(fā)育異常，而且也可以修復骨質(zhì)發(fā)育異常。最新研究表明，在移植后的脊髓組織中發(fā)現(xiàn)大量存活的干細胞，并可轉(zhuǎn)化為星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，彌補神經(jīng)功能的巨大缺失[2]。STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)在神經(jīng)胚胎發(fā)育過程中，細胞凋亡和細胞信號傳導的調(diào)節(jié)以及干細胞的分化和轉(zhuǎn)化過程中均發(fā)揮不可估量的作用。此外，STAT3在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的多個生理階段，神經(jīng)細胞的存活和損傷后修復的調(diào)節(jié)均有重要作用[3]。慢病毒為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，因其具有感染率高、可感染不分裂的細胞，整合表達穩(wěn)定、對神經(jīng)元具有高度親嗜性等優(yōu)勢，可作為神經(jīng)系統(tǒng)非常理想的載體[4]。本課題設(shè)計利用慢病毒-STAT3質(zhì)粒標記骨髓間充質(zhì)干細胞對顯性脊柱裂大鼠在第16天進行胚胎期移植，觀察STAT3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對干細胞移植過程中神經(jīng)分化的效果影響。為更好地服務于臨床產(chǎn)前診斷，早期治療小兒顯性脊柱裂畸形奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1顯性脊椎裂畸形胎鼠模型的構(gòu)建:將孕Wistar大鼠在受孕第10天(E10)給予4%維甲酸一次性胃管注射(135mg/kg)，從而誘導顯性脊柱裂動物模型。

1.2慢病毒STAT3過表達載體的構(gòu)建:慢病毒STAT3過表達載體購自廣州源井生物科技有限公司，選取pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro片段作為質(zhì)粒的克隆載體。克隆切入點是XhoI/BamHI，編號為U06922。合成后經(jīng)基因測序驗證，進一步證實序列準確性。

1.3慢病毒細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組:取生后10d Wistar大鼠股骨骨髓組織，在無菌條件下提取BMSCs，采用全骨髓貼壁法分離和純化BMSCs。本研究采取第3代BMSCs，在6孔板中接種上述細胞，待融合率達到50%時開始慢病毒轉(zhuǎn)染，慢病毒滴度維持在3×107(MOI=50)，利用慢病毒作為載體將STAT3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BMSCs上 (MOI值300～500)。根據(jù)病毒轉(zhuǎn)染情況分為如下三組：空白對照組，未轉(zhuǎn)染慢病毒的BMSCs；陰性對照組，轉(zhuǎn)染無序列質(zhì)粒載體慢病毒的BMSCs；實驗組，轉(zhuǎn)染STAT3過表達載體慢病毒的BMSCs。

1.4骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定:通過流式細胞檢測法對CD34，CD45，CD73和CD90表面蛋白進行測定，為BMSCs的提取和鑒定提供科學依據(jù)。

1.5通過CCK-8試劑盒測定細胞活性:首先完善干細胞計數(shù)，在96孔4板中接種細胞，每孔細胞量維持不低于5×104個，同時設(shè)置2個復孔，37℃細胞培養(yǎng)箱中進一步孵育，選取在6，12，24，48和72h每孔加入10μL CCK-8溶液，檢測波長在450nm時OD值。

1.6骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療:在孕鼠第16天(E16)時，經(jīng)10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后，三次腹壁清理及消毒后，依次經(jīng)過腹壁，宮壁和羊膜囊，暴露胎鼠，計數(shù)宮內(nèi)存活胎鼠數(shù)量及部位，在顯微鏡下分離胎鼠腰骶部。明確有無畸形后，經(jīng)微量注射器迅速注射0.2μL未轉(zhuǎn)染慢病毒的BMSCs(空白對照組)、轉(zhuǎn)染無序列質(zhì)粒載體慢病毒的BMSCs(陰性對照組)、轉(zhuǎn)染STAT3過表達載體慢病毒的BMSCs(實驗組)。迅速縫合宮壁、關(guān)閉腹腔，待孕鼠麻醉恢復正常后放回籠中繼續(xù)觀察。待飼養(yǎng)至20d時，根據(jù)分組，取出胎鼠脊髓組織。

1.7實時熒光定量PCR檢測:加入RNA裂解液1mL，用無菌剪刀剪碎研磨，再次加入1mLRNA裂解液，注射器吹打成勻漿狀。加入200μL氯仿充分混勻，13000rpm 4℃下離心15min。小心吸取上清，加入500μL異丙醇。4℃放置30min，13000rpm 4℃下離心15min。棄上清，沉淀物加入1000μL 70%酒精，漂洗一次。再次離心，吸取上清，沉淀物加入DEPC水20μL后制備成RNA樣本并檢測濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑反應說明書，配制反應體系。反應條件為：①95℃，0.5min，1個循環(huán)；②95℃，5sec；60℃，34sec，40個循環(huán)；③95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec，1個循環(huán)。統(tǒng)計擴增結(jié)果并進行統(tǒng)計分析。Real Time-PCR Master Mix中的SYBR Green染料的熒光信號的強弱強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，根據(jù)熒光信號的強弱檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。在60℃設(shè)置熒光檢測點，以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果以相對數(shù)值，即2-△△Ct表示。

1.8Western-blot檢測:按照分組分別100mg脊髓組織加入1.5mLRIPA裂解液，組織勻漿機打碎組織，重復三次，均在冰上操作，每次約10sec。吸取上清液至EP管中，將EP管置于冰上裂解30min。然后將EP管于4℃下12000rpm離心15min，吸取上清至EP管中，即為提取的脊髓組織總蛋白。經(jīng)過制膠、蛋白上樣液、SDS-PAGE、封閉、洗膜、一抗和二抗孵育。將ECL試劑盒中的A、B試劑等體積混合后暗室曝光進行發(fā)光顯影，Western Blot成像系統(tǒng)進行圖像的采集。應用Image-J軟件對條帶進行掃描及灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1Wistar大鼠移植前骨髓間充質(zhì)干細胞流式細胞鑒定結(jié)果:通過流式細胞技術(shù)檢測4種表面標記物。結(jié)果表明：CD73和CD90表面標記物陽性，CD34和CD45標記物陰性(見圖1)。其中，CD73和CD90為骨髓間充質(zhì)干細胞表面纖維蛋白和核糖體受體，為非造血細胞起源。而CD34和CD45是內(nèi)皮細胞和造血細胞的表面受體，提示W(wǎng)istar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離成功。

圖1 流式細胞結(jié)果提示骨髓間充質(zhì)干細胞分離成功

2.2CCK-8檢測移植前各組細胞增殖活性:以4，8，12，16，20，24，48和72h為時間節(jié)點，檢測空白對照組，陰性對照組和實驗組移植前骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖活性。結(jié)果提示：三組活細胞量在時間節(jié)點無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。提示慢病毒轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖活性無顯著影響，見圖2。

圖2 CCK-8細胞增殖曲線(移植前)

2.3CCK-8檢測移植后各組細胞增殖活性:在移植后的第4天(E20)取出胎鼠脊髓，以4，8，12，16，20和24h為時間節(jié)點，對空白對照組，陰性對照組和實驗組分別檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖活性，測定各組活細胞的OD值。結(jié)果提示：實驗組在移植后的第8小時OD值最高，之后逐漸下降，與空白對照組和陰性對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而空白對照組和陰性對照組檢測后OD值高峰時間和峰值均無統(tǒng)計學差異，如圖3所示。

圖3 CCK-8細胞增殖曲線(移植后)

2.4移植后利用實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測各組脊髓組織中STAT3和pSTAT3的表達:經(jīng)RT-PCR檢測，與空白對照組和陰性對照組相比，在實驗組中pSTAT3 mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05),而STAT3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。Western-blot法STAT3和pSTAT3相對蛋白表達趨勢與實時熒光定量PCR結(jié)果一致，見表2和圖4。

圖4 Western-blot法檢測各組脊髓組織中STAT3和pSTAT3的表達情況

表1 空白對照組陰性對照組和實驗組STAT3 pSTAT3 mRNA表達水平比較

表2 空白對照組陰性對照組和和實驗組STAT3 pSTAT3 蛋白表達水平比較

2.5實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中神經(jīng)標志物GFAP，NSE，NF和Nestin的表達:見表3，空白對照組、陰性對照組和實驗組三組GFAPmRNA相對表達量具有統(tǒng)計學差異。其中，在實驗組中GFAP mRNA相對表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。同時，NSE，NF和Nestin mRNA在各組中的相對表達趨勢與GFAP基本一致。另外，GFAP，NSE，NF和Nestin蛋白表達趨勢與實時熒光定量PCR結(jié)果完全相同，見表4和圖5。

表3 空白對照組陰性對照組和實驗組GFAP NSE NF和Nestin mRNA表達水平比較

表4 空白對照組陰性對照組和實驗組GFAP NSE NF和Nestin 蛋白表達水平比較

圖5 Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中神經(jīng)標志物GFAP，NSE，NF和Nestin的表達情況

2.6實時熒光定量PCR和Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中凋亡信號分子Caspase-8和Bcl-2的表達量:從表5 RT-PCR的結(jié)果中，我們可以發(fā)現(xiàn)：Caspase-8和Bcl-2在實驗組的相對表達水平要顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。經(jīng)Western-blot法進一步驗證，結(jié)論與RT-PCR一致，見表6和圖6。

表5 空白對照組陰性對照組和實驗組Caspase-8 Bcl-2 mRNA表達水平比較

表6 空白對照組陰性對照組和實驗組Caspase-8 Bcl-2蛋白表達水平比較

圖6 Western-blot法檢測移植后各組脊髓組織中凋亡信號分子Caspase-8和Bcl-2的表達量

3 討 論

信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT3)來源于白介素-6(IL-6)作用于效應細胞后產(chǎn)生的急性期反應因子。多項研究表明STAT3可被眾多細胞因子激活，如被活化的JAKs、IL-4和IL-12等[5]。在細胞內(nèi)，STAT3呈無活性非磷酸化單體形式，一旦被細胞因子等特異性刺激后，即發(fā)生磷酸化，繼而發(fā)生同源或異源二聚化轉(zhuǎn)變，隨后進入細胞核，與特異核酸序列結(jié)合，啟動下游各種靶基因表達。我們在研究中嘗試采用過表達技術(shù)，構(gòu)建STAT3過表達質(zhì)粒，結(jié)合慢病毒的高轉(zhuǎn)染效率，穩(wěn)固轉(zhuǎn)染BMSCs，觀察到經(jīng)CCK-8檢測，實驗組在移植后的第8小時OD值達到峰值，細胞增殖活性較空白對照組和陰性對照組顯著增強，提示STAT3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可明顯促進骨髓間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)細胞之間轉(zhuǎn)化。同時，從RT-PCR和Western-blot二個層面，pSTAT3在實驗組中表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組，而實驗組中STAT3水平顯著降低，提示STAT3在移植治療過程中即發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)變，啟動下游各種靶基因的表達，促進BMSCs的轉(zhuǎn)分化和神經(jīng)細胞的增殖分化。

本研究還發(fā)現(xiàn)：實驗組的GFAP mRNA相對表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組。NSE，NF和Nestin的mRNA各組相對表達量趨勢與GFAP相同。另外，GFAP，NSE，NF和Nestin相對蛋白表達量趨勢與實時熒光定量PCR結(jié)果完全相同。GFAP，NSE，NF和Nestin均來源于神經(jīng)細胞表面的標識蛋白，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質(zhì)細胞活化后的表面標志物[6]，維持細胞骨架的可塑性和張力強度；血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是一種特異性酸性蛋白酶，常見于多種神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及神經(jīng)元[7]；神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament，NF)作為神經(jīng)細胞軸突中間絲的重要組分，可穩(wěn)固神經(jīng)纖維的彈性，使伸展發(fā)生正常并防止中斷。巢蛋白(Nestin)又被稱為第Ⅵ類中間纖維，研究表明是胰腺干細胞和神經(jīng)干細胞的表面標志蛋白，是中間纖維家族的重要成員。本研究從基因和蛋白兩個水平，證實將慢病毒介導STAT3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，可以有效提高其向神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)化效率，使神經(jīng)細胞的標記物(GFAP，NSE，NF和Nestin)相對表達量明顯增高。STAT3通過JAK/ STAT途徑與其他信號通路如MAPK途徑的對話，參與神經(jīng)調(diào)節(jié)細胞因子(neuroregulatory cytokine)，白血病抑制因子(leukemia inhibtiory factor,LIF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF) 等對神經(jīng)前體細胞分化命運的調(diào)節(jié)，在此過程中STAT3抑制因子SOCS家族作為負反饋蛋白抑制JAK的活性。且STAT3在GFAP，NSE，NF和Nestin的啟動子上有相應的結(jié)合位點，在特定因子的誘導下大腦皮層前體細胞分化為形成膠質(zhì)細胞，啟動GFAP，NSE，NF和Nestin基因的轉(zhuǎn)錄[8]。由此認為STAT3與神經(jīng)細胞的分化密切相關(guān)。

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)是兒童相當常見的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形，近年來逐漸增多，約占總出生人數(shù)0.1%-0.9%。神經(jīng)溝中部或尾部閉合缺陷則引起脊柱裂[9]。最新研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育經(jīng)歷一系列復雜的生物學過程，涉及神經(jīng)細胞和神經(jīng)元的增殖、分化、凋亡、自噬，神經(jīng)突觸形成，信號傳遞和轉(zhuǎn)導以及神經(jīng)網(wǎng)絡核團形成等。細胞凋亡作為生物細胞特殊形式的程序死亡，受周圍組織多種效應細胞的參與和調(diào)控，因此對生命活動的多個過程，如胚胎組織的早期發(fā)育、器官組織的形態(tài)發(fā)生以及效應器官的功能形成等均發(fā)揮巨大的調(diào)控作用。一旦細胞凋亡過度，則可引起體內(nèi)相應神經(jīng)細胞和脊髓組織受損，形成臨床上常見的脊柱裂畸形[10]。骨髓間充質(zhì)干細胞具有自我更新和多向分化潛能等生物學特點,在特定的理化環(huán)境和細胞因子誘導下能夠轉(zhuǎn)化為多種細胞類型。最近研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，神經(jīng)元，肌細胞以及成骨、破骨細胞等[11]。因此，BMSCs是組織工程一種比較理想的種子細胞來源，干細胞移植治療先天性脊椎裂有望成為治療先天神經(jīng)發(fā)育畸形最有前途的方法之一。本研究中，從基因蛋白兩個水平，移植后實驗組caspase-8和Bcl-2表達水平明顯低于空白對照組和陰性對照組，提示STAT3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs可以顯著抑制脊柱裂發(fā)病的凋亡進程，通過Caspase-8和Bcl-2兩個重要凋亡分子作用發(fā)揮抗凋亡效應。研究表明[12]：STAT3參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的分化，JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑是能夠決定細胞分化的一個重要機制，調(diào)控著相關(guān)基因的表達。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，STAT3與其他信號途徑協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)前體細胞的分化命運，STAT3結(jié)合元件的甲基化狀態(tài)還決定了細胞的分化潛能。STAT3與神經(jīng)干細胞的增殖密切相關(guān)，在成熟的神經(jīng)細胞或膠質(zhì)細胞中均高度表達，提示STAT3對神經(jīng)上皮細胞早期的分化起重要調(diào)控作用。

綜上所述，構(gòu)建STAT3過表達質(zhì)粒通過慢病毒介導的方法轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，可以提高其向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的效率，為先天性脊柱裂的治療提供新的種子細胞。