徐方蔚，陳海鵬，霍婧偉，路 晨，李盼盼，陳宇航，廖欣婷，吳力群

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100078 2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院兒科，北京 100078)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以咳嗽為惟一或主要癥狀的特殊類型哮喘，也是兒童慢性咳嗽中最常見的疾病。其發(fā)病機制與典型哮喘相似，是由多種炎性細胞共同參與的氣道慢性炎癥，并由此引起的氣道高反應性[1]。但在關于CVA動物模型的研究中目前尚無明確區(qū)別于一般典型哮喘動物模型建立方法的報道[2]。本課題組長期致力于兒童咳嗽變異性哮喘的臨床及基礎研究，參照哮喘豚鼠模型進行改良，觀察三種CVA豚鼠造模方法在氣道反應性、氣道炎癥和病理方面的差異，評價各模型的效度及信度。

1 實驗材料

1.1實驗動物:雄性健康SPF級Hartley豚鼠，30只，約3周齡，體重230～280g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：[動]SYXK(京)2019-0013。豚鼠為群居動物不宜單籠飼養(yǎng)，按體型每籠3～5只為宜。

1.2試劑和儀器

1.2.1卵蛋白(OVA)：索萊寶(Solarbio)公司，Lot No：421C033。氫氧化鋁：國藥集團化學試劑有限公司，批號：20131125。烏拉坦：SIGMA公司，批號：MFCD00007966。辣椒素：源葉生物有限公司，20mg，批號：P12D9S77366。環(huán)磷酰胺：Coolaber公司，1g，Lot No：CC29183901。

1.2.2辣椒素溶液配制:即配即用，取辣椒素，加入吐溫-80溶液、無水乙醇以及生理鹽水，配成10-4moL/L的辣椒素溶液[3]。

1.2.3乙酰甲膽堿溶液:分別配制成0.08mg/mL，0.04mg/mL和0.02mg/mL的溶液。

1.2.4霧化器:飛利浦Philips公司生產(chǎn)Sami型霧化器，霧化器輸出流量5L/min。

1.2.5小動物肺功能儀:Ani Res2005動物肺功能儀及分析軟件系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1造模:將實驗動物按體重由低到高分層隨機，分為4組，分別為正常對照組、模型A組、模型B組，模型C組，對照組6只，其余每組8只豚鼠。動物模型參考文獻[4]制定。模型A：第1天每只豚鼠注射2% OVA和200mg氫氧化鋁的混懸液1mL；第8天每只豚鼠注射0.01mg OVA和100mg氫氧化鋁的混懸液1mL加強致敏1次；第15天起，用1% OVA溶液霧化(霧化率3mL/min持續(xù)時間20s并逐漸延長霧化時間至90s攻擊)，隔日一次，共7次。模型B：第1天肌注4% OVA溶液0.5mL，同時腹腔注射2% Al(OH)3 0.2mL致敏；第15天起，用1% OVA溶液霧化，方法同前，隔日一次，共7次。模型C：第1天腹腔內(nèi)注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(30mg/kg),第3天每只豚鼠注射2mg OVA和200mg氫氧化鋁的混懸液1mL，第22天腹腔注射0.1mg卵蛋白和100mg氫氧化鋁混合液加強免疫免疫反應；第23天起用1% OVA溶液霧化，方法同前，隔日一次，共7次。正常對照組給予同樣劑量的生理鹽水。

2.2觀察指標

2.2.1氣道敏感性(咳嗽反應的測定)1% OVA最后一次霧化攻擊后的第2天，將豚鼠置于密閉空間霧化吸入10-4moL/L辣椒素溶液60s，然后關掉霧化器，停留60s后掀開蓋子取出豚鼠，記錄此時開始2min內(nèi)各豚鼠的咳嗽次數(shù)。

2.2.2氣道高反應性的測定:采用動物肺功能檢測系統(tǒng)(PFT系統(tǒng))，觀察豚鼠氣道阻力(RI)的變化。選取20%烏拉坦溶液按1g/kg對各組豚鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉，備毛，分離氣管及頸外靜脈，行氣管插管并固定，分離兩側(cè)頸靜脈，穿好線備用。將豚鼠仰臥平放體描箱內(nèi)(必要時可將豚鼠頸部墊起抬高)，將氣管插管與呼吸機連接，頸外靜脈穿刺并固定，連接外接注射裝置，密封體描箱。小動物呼吸機呼吸頻率設定為65次/min，潮氣量設定為6mL/kg。待呼吸穩(wěn)定后，測定此時基值，然后進行激發(fā)，激發(fā)試劑和順序分別為:0.5mL生理鹽水及濃度為0.02、0.04、0.08mg/mL的乙酰甲膽堿各0.5mL。每次注射后記錄下每個濃度級別下的RI值及對應的時間，待氣道總阻力降至正常后開始下一個劑量的注射。

2.2.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù):結(jié)扎左肺門，通過氣管插管，以較小的壓力將5mL生理鹽水緩慢注入肺中，可見右肺逐漸變得膨隆、蒼白，停留30s后，緩慢回抽灌洗液，注入橙色帽管內(nèi)，重復上述操作3次。將收集的BALF進行4℃離心，1500r/min，10min，立即取細胞沉渣進行嗜酸性粒細胞直接計數(shù)，并計算出嗜酸性細胞的百分率。

2.2.4肺組織HE染色:收集BALF之后快速結(jié)扎右肺門，在左心耳剪開一口，從右心房進針進入肺主動脈，緩慢推入生理鹽水，將豚鼠肺中血水沖出，再用4%多聚甲醛的PBS從氣管緩慢注入，見左肺輕度膨隆即可。剪下左肺中下葉置于福爾馬林中保存固定。將固定好后的肺組織常規(guī)進行石蠟包埋，4μm切片，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，水干后蘇木素染色5min，清水沖洗吹干后用鹽酸乙醇分化30s，用清水浸泡15min后吹干，置伊紅液2min，再進行脫水、透明、中性樹脂封固。參考文獻[5]擬定病理切片量化分級標準，主要從血管及支氣管嗜酸性粒細胞浸潤、水腫及上皮細胞損傷程度三個方面進行評價。

3 結(jié) 果

3.1豚鼠咳嗽次數(shù):各組豚鼠咳嗽次數(shù)見表1。在實驗觀察中模型A及模型B中各有2只豚鼠在卵蛋白霧化后即出現(xiàn)明顯喘息，辣椒素刺激后亦出現(xiàn)明顯的喘咳。

表1 各組豚鼠辣椒素刺激后咳嗽次數(shù)的比較

3.2豚鼠氣道高反應性:各組豚鼠在激發(fā)后的氣道阻力變化如圖1，每組各得到4組RL值(分別為注射生理鹽水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL時的RL值)，見表2。對比空白組，對于生理鹽水、MeCh0.02、0.04、0.08mg/mL，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。3組模型組之間兩兩比較有差異，P<0.05。在MeCh0.04mg/mL劑量下氣道阻力A組>B組>C組。

表2 不同劑量乙酰甲膽堿激發(fā)試驗氣道總阻力曲線下面積(RL-area)比較(cmH2O/mL)

圖1 各組豚鼠在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后氣道阻力變化

3.3 BALF中嗜酸性粒細胞百分比:各組BALF中嗜酸性粒細胞百分比見表3。與空白對照組比較，3個模型組豚鼠的BALF中嗜酸性粒細胞百分比明顯升高(P<0.05)，而3個模型組間比較中，雖然如圖2所示，模型B組的百分比增高明顯，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.051)。

圖2 各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分比

表3 各組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分比的比較

3.4各組豚鼠肺部病理結(jié)果:空白組豚鼠氣道結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎性細胞浸潤；各模型組氣道表現(xiàn)氣道上皮細胞被破壞，黏膜下大量炎癥細胞浸，氣道平滑肌增生。見圖3。根據(jù)豚鼠肺部病理分級評分，空白組為(2.4±0.20)分，模型A組(6.4±0.34)分和模型B組(7.8±0.51)分以及模型C組(6.4±0.36)分，3個模型組豚鼠的肺組織病理學評分明顯升高(P<0.05)，以模型B組升高明顯，但是3個模型組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖3 各組豚鼠肺組織HE染色結(jié)果

圖4 各組豚鼠肺組織病理炎癥分級評分

4 討 論

4.1三種造模方法的比較:在造模方法上，由日本金澤大學研究并引入的咳嗽變異性哮喘豚鼠模型，給我國CVA動物實驗模型提供了一個很好的參考[6]。但該造模方法激發(fā)時只用1%OVA霧化1次，持續(xù)90s，在本研究團隊前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)，由于豚鼠個體差異性較大，對于激發(fā)時間有豚鼠10s即出現(xiàn)高度的氣道痙攣，如不進行及時搶救會出現(xiàn)窒息死亡。故霧化刺激時，從10s開始逐漸適應性延長，且CVA屬于慢性咳嗽的一種，針對慢性炎癥模型的建立方法與急性相比，主要區(qū)別在于激發(fā)時間更長。譚杰軍等[7]研究為了更好地模擬氣道慢性炎癥過程這一哮喘本質(zhì)，延長了霧化激發(fā)時間，為連續(xù)激發(fā)14d，本研究避免長時間OVA刺激而產(chǎn)生的脫敏效應，改為OVA激發(fā)隔日一次，共7次，從而可形成典型的慢性變應性炎癥模型。近幾年，國內(nèi)多家實驗中心也在該模型基礎上進行了方法上的改進。本實驗研究查閱國內(nèi)外文獻后篩選三種CVA豚鼠造模方法，在致敏階段進行借鑒，各方面比較見表4。

表4 三組造模方法的具體比較

4.2模型評價標準:與臨床診斷相類似，沒有嚴格的標準來區(qū)分咳嗽變異性哮喘和典型哮喘，目前也沒有明確的評價標準來界定CVA動物模型和支氣管哮喘動物模型。因此建立與臨床癥狀相似度更高的CVA動物模型以及合適的模型評價標準也是開展CVA研究的關鍵問題。判斷一個CVA動物模型是否成功可以在哮喘本質(zhì)認識的基礎上，看所造模型是否有如下變化：①造模后行為學表現(xiàn)(主要表現(xiàn)為刺激后咳嗽)；②肺組織HE染色是否炎性細胞浸潤，是否以嗜酸性粒細胞(EOS)為代表；③BALF中細胞計數(shù)，重點是以EOS是否升高；④肺功能指標，如RI、RL、Re等。具體判定時也應從這三個方面與哮喘模型區(qū)分：①氣道激發(fā)試驗時，其氣道阻力應較哮喘輕，且氣道阻力也應隨著激發(fā)濃度升高而逐漸上升；②肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞計數(shù)較哮喘的少；③行為學上無明顯喘息癥狀。

哮喘動物模型的行為學分級標準：共分4級，分別為呼吸困難，咳嗽，跌倒，死亡。而咳嗽變異性哮喘模型沒有明確的行為學標準，一些研究按哮喘動物模型的行為學分級標準進行判定是不準確的，按照咳嗽變異性哮喘的臨床癥狀應以咳嗽作為主要判定標準，指南[8]中推薦引起咳嗽5次的最低辣椒素濃度來對咳嗽敏感性進行描述，而一般動物實驗中常采用固定辣椒素濃度進行檢測，以咳嗽次數(shù)作為敏感性的判定標準，故本實驗研究暫定5次為最小次數(shù)標準。研究結(jié)果中，三組模型的咳嗽次數(shù)均達到5次以上，但相比于其他類似的實驗研究結(jié)果，本次咳嗽次數(shù)相對較少，考慮與激發(fā)物、激發(fā)物濃度以及激發(fā)時間和觀察時間均有相關。在激發(fā)時間上不同文獻均有差異，王謙等[4]研究通過反復造模摸索發(fā)現(xiàn)0.5mmoL/L辣椒素霧化2min，在此條件下豚鼠咳嗽頻次計數(shù)較為可靠。大部分研究的觀察時間在2min，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，2/3的豚鼠在結(jié)束激發(fā)后并不立即出現(xiàn)咳嗽，而在2min后出現(xiàn)頻繁的咳嗽，故可將觀察時間延長為3min。

從病理切片上看，空白組豚鼠支氣管結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的炎性細胞浸潤；各模型組豚鼠肺組織病理表現(xiàn)：①支氣管壁局部黏膜上皮可見損傷及脫落；②各層管壁可見充血、水腫；③支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤，并以嗜酸性粒細胞(圖中紅色顆粒狀)為主。如圖3中所示，其中模型B損傷最重，可能與致敏藥物濃度大有關。本研究采用Underwood[8]提出用于評估抗原攻擊的豚鼠肺部炎癥變化的組織病理學評分系統(tǒng)，主要對豚鼠肺組織血管及支氣管嗜酸性粒細胞浸潤、水腫、上皮細胞損傷三個方面進行評分評估，依據(jù)每個方面的嚴重程度給予0～5分的評分，評分高的說明組織的炎癥浸潤程度也越高。三個模型組BALF中嗜酸性粒細胞比例也明顯增高，說明三種方法造出的豚鼠CVA模型肺部病理上均是成功的。

在中華醫(yī)學會兒科分會呼吸學組關于CVA的診斷標準中提到患兒肺功能正常，支氣管激發(fā)試驗提示氣道高反應性，故有必要將小動物肺功能檢測納入到評價指標中。在實驗結(jié)果中三組模型的氣道阻力較空白組均有增大，但模型A、B組的氣道阻力過高，結(jié)合二組中均有豚鼠出行喘息癥狀，考慮模型癥狀偏重，更類似于哮喘，而模型C組氣道阻力表現(xiàn)更為平穩(wěn)。本實驗的肺功能測定是通過采用有創(chuàng)的方法實現(xiàn)的，需要行頸靜脈穿刺術，將激發(fā)試劑不同濃度的乙酰甲膽堿注射入豚鼠靜脈內(nèi)，檢測其氣道阻力。實驗前備毛，分離靜脈時盡量將包裹靜脈的筋膜剝離干凈，穿刺前注意針管的通暢，這些都影響穿刺成功率，該操作對實驗研究人員技術要求較高，本次實驗中B組中有2只豚鼠因穿刺術時間過長而死亡，相比Li等[9]采用無創(chuàng)方法所測定增強呼吸間歇(Penh)，操作簡便，對動物傷害較少，且能重復操作，可以在不同的時間點進行多次測定，更能體現(xiàn)實驗過程中豚鼠氣道阻力的變化，從而有助于確定造模的時長、藥物激發(fā)濃度等等。

綜上，本試驗研究三種模型的咳嗽癥狀和氣道高反應性大致符合CVA的臨床癥狀的特征，其中模型A與模型B中出現(xiàn)4只明顯喘息的豚鼠，模型C的行為學表現(xiàn)和氣道高反應性表現(xiàn)更為穩(wěn)定。在BALF中嗜酸性粒細胞比例，A與C組的比例以及病理結(jié)果與臨床上咳嗽變異性哮喘和典型哮喘的差別。由此我們認為所建立的模型C組造模方法可行性更佳，但關于CVA動物模型的評價標準以及檢測指標上還需要更多的實驗研究將其進行規(guī)范。