劉彩玉 楊麗亞 田冬梅

[關(guān)鍵詞]蘿卜硫素;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌;凋亡;增殖;lncRNA MALAT1/TFEB信號通路;機(jī)制

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SSCC）是最常見的皮膚癌，僅次于基底細(xì)胞癌，占全球已知皮膚癌的20%～50%[1]。手術(shù)治療只對早期或已確診的SSCC患者有效，而對伴發(fā)其他疾病和使用免疫抑制劑或抗凝劑的老年患者不適合手術(shù)治療，還會對患者外貌帶來不良影響[2-3]。因此，尋找高效、低副作用的新型抗腫瘤藥物迫在眉睫。蘿卜硫素抗腫瘤活性的研究更加受到重視，并且其還具有防治皮膚癌和光防護(hù)作用，主要包括預(yù)防皮膚炎癥、紅斑、皮膚上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、光老化及皮膚腫瘤等[4]，其中對黑素瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用[5]。然而，關(guān)于蘿卜硫素對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的藥理抑制作用研究甚少，于是本文探討了蘿卜硫素對A431細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料：人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株（上海ATCC細(xì)胞庫）;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）;CCK-8試劑盒（Solarbio公司）;RIPA裂解液（杭州四季青公司）;BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)）;Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（北京四正柏生物公司）;Caspase-3/9活性檢測試劑盒（Solarbio公司）;兔抗鼠t-PARP、cle-PARP、cle-Caspase-3、TFEB、TFEB（Ser142）及β-actin抗體（美國CST公司）;羊抗兔IgG二抗（上海谷歌生物公司）;ELC化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Advansta）。

1.2 主要儀器：BIORAD-550型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）;BBS-V800型單人超凈臺（山東鑫貝西公司）;SPX-250型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;GE-100型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）;Amersham Imager 600儀器（BIORAD，美國）;FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BectonDickinson公司）。

1.3 A431細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清和1%抗生素的的DMEM培養(yǎng)基對A431細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5%CO2、37℃恒溫。待細(xì)胞融合至90%左右時，便進(jìn)行傳代培養(yǎng)。首先PBS清洗細(xì)胞2遍，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至Ep離心管，1 000rpm離心5min，棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.4 CCK-8實(shí)驗：將對數(shù)期A431細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后加入5～40μg/ml的蘿卜硫素處理細(xì)胞24、48、72、96h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100μl含10μl的CCK-8試劑的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5h，在酶標(biāo)儀450nm波長處檢測細(xì)胞吸光度OD值，并計算細(xì)胞相對活力。計算公式如下：細(xì)胞相對活力（%）=OD實(shí)驗組/OD對照組×100%。

1.5 細(xì)胞克隆數(shù)分析：將對數(shù)期A431細(xì)胞接種于6孔板，每孔1 000個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，然后加入5～40μg/ml的蘿卜硫素處理細(xì)胞6d后，每2d更換一次含藥的新鮮培養(yǎng)液;然后對克隆細(xì)胞進(jìn)行染色并計數(shù)。

1.6 BrdU ELISA實(shí)驗：將對數(shù)期A431細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜;5～40μg/ml的蘿卜硫素處理細(xì)胞48h后，加入BrdU試劑孵育12h;再采用ELISA試劑盒檢測BrdU偶聯(lián)的細(xì)胞，并在酶標(biāo)儀450nm處測定其吸光度OD值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)：收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次，采用2.0mg/ml的PI染液和RNase I染色30min，流式細(xì)胞儀立即檢測細(xì)胞周期分布情況。另外，收集細(xì)胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說明書進(jìn)行），最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.8 RT-PCR實(shí)驗： 收集各組細(xì)胞， PBS清洗2次， 用T R I z o l 試劑提取總R N A ， 采用1 m g 的R N A 、隨機(jī)引物和AffinityScript QPCR cDNA合成試劑逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再利用iQ5實(shí)時PCR儀擴(kuò)增lncRNA MALAT1基因產(chǎn)物，引物序列如下：正向5‘-AGGCGTTGTG-CGTAGAGGA-3，反向5‘-GGATTTTTACCAA-CCACTCGC-3。

1.9 Western blot實(shí)驗：收集各組細(xì)胞，每組加入200μl的裂解液，置于冰上充分裂解30min，收集細(xì)胞裂解液，4℃條件下離心12 000rpm，收集上清。BCA法檢測了上清中總蛋白濃度，每孔上樣40μg進(jìn)行電泳分離，恒壓70V，電泳3h。然后在恒流275mA條件下電轉(zhuǎn)70min，5%脫脂牛奶封閉1h后，將目的條帶放入對應(yīng)的一抗溶液（稀釋比1 ： 1 000）中，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，再把條帶放入盛二抗（稀釋比1：3 000）的平皿中室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。加入4ml的ECL顯影液顯色3min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.10 Caspase活性試驗：收集各組細(xì)胞，采用Caspaseglot-3/-9活性測定試劑盒檢測Caspase-3/9活性，酶標(biāo)儀在405nm處測定其吸光度值。

1.11 lncRNA MALAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：ANXA3 mimics質(zhì)粒由武漢巴菲爾生物有限公司合成，采用Lipofectamine 2 000試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至A431細(xì)胞，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P <0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。