梁莉 許亦權(quán) 楊楠 王辰

[關(guān)鍵詞]牙周膜干細胞;內(nèi)皮素-1;絲裂原激活蛋白激酶;Runx2;骨鈣素;牙周炎

牙周炎導致牙槽骨出現(xiàn)損傷，所以骨再生是牙周病診治的重中之重。牙周膜干細胞（Periodontal ligamentstem cells，PDLSCs）作為骨再生的不可忽視的一大細胞[1]。干細胞參與骨再生過程，并且受很多因子影響，內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是多功能因子，在該疾病患者的牙槽骨吸收中起到了不可忽視的效用[2-3]。在之前實驗中了解到ET-1經(jīng)過絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）信號通路促進PDLSCs的成骨分化，但具體機制尚不清楚[4]。因此，本實驗旨在研究MAPKs信號通路在ET-1調(diào)控PDLSCs成骨分化過程中的作用機制，為牙周炎患者骨組織修復再生提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑：內(nèi)皮素-1（美國Abcam公司），α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（FCS），胰蛋白酶（美國Gibco公司），Trizol（Invitrogen公司），Real-time PCR試劑盒（Takara公司），Western blot檢測試劑盒及NC膜為Amersham公司產(chǎn)品。

1.2 體外分離PDLSCs細胞：使用13歲由于正畸原因而拔除的前磨牙患者牙齒，在無菌條件下用PBS反復沖洗牙根表面，收集牙根表面有牙周膜覆蓋部分的牙周韌帶組織，剪碎后用膠原纖維酶消化處理為單細胞懸液。用含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1周左右，胰酶消化細胞。以每孔0.1ml的濃度將細胞接種于96孔板，隔天換液，1周左右后將具有克隆形成的細胞挑選出，標記為原代細胞。原代細胞繼續(xù)接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞融合至70%時，按照1：3的比例傳代，取3～4代細胞進行實驗。使用流式細胞儀對已經(jīng)得到的細胞進行干細胞表面分子標志物測定過程。

1.3 細胞處理：牙周膜干細胞依照1×105/孔的密度在6孔板中進行培養(yǎng)，等待生長12h后，觀察其貼壁情況，使用α-MEM培養(yǎng)基對其培養(yǎng)。次日將孔中的培養(yǎng)液吸出，添加新的培養(yǎng)液，之后在向培養(yǎng)孔中添加MAPK信號通路的三種通路抑制劑，ERK通路抑制劑PD98059，JNK通路抑制劑SP600125，p38α通路抑制劑SB203580。之后再添加100nMET-1，培養(yǎng)2周后，以未作任何處理的牙周膜干細胞為空白對照，以單獨加入抑制劑的牙周膜干細胞為陰性對照，采用實時定量PCR和Western blot檢測各組細胞Runx2和OCN的表達。

1.4 實時定量PCR檢測：用Trizol法抽提細胞總RNA，按試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用Primer Premier 5設(shè)計目的基因、內(nèi)參基因GAPDH的引物，引物序列（見表1）。PCR擴增條件：95℃預變性30s;95℃ 5s，60℃ 34s，95℃15s，60℃ 60s，95℃ 15s。將GAPDH作為內(nèi)參對照，將Runx2和OCN基因得值與樣品內(nèi)參基因得值進行相比，獲得Runx2以及OCN基因相對mRNA表達量值。

1.5 Western blot檢測：取對數(shù)生長期細胞，依照常規(guī)方法進行裂解，從而獲得蛋白，去其上清檢測其蛋白定量，使用濃度為12% SDS-PAGE凝膠電泳，將其蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，TBST液洗滌印跡膜5min×3次。放入5%脫脂奶粉/TBST封閉液內(nèi)，室溫封閉1h。加入Runx2、OCN和GAPDH抗體，4℃過夜。棄一抗，TBST洗滌15分鐘/次×3次。加二抗抗體，室溫1h。最后ECL顯色，X線壓片曝光。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用統(tǒng)計軟件進行分析處理。實驗數(shù)據(jù)以x?±s表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD-t 檢驗。P <0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實時定量PCR結(jié)果：空白組與陰性組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。與空白組和陰性組相比較，ET-1處理組、ET-1+SP組和ET-1+SB組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA表達顯著增強（P <0.05）;而ET-1+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA的表達沒有明顯變化（P >0.05）。與ET-1處理組相比較，ET-1+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN mRNA表達顯著降低（P <0.05）。見圖1。

2.2 Western blot檢測結(jié)果：結(jié)果顯示ET-1明顯增強了PDLSCs組、PDLSCs+SP組和PDLSCs+SB組牙周膜干細胞Runx2和OCN蛋白的表達（P <0.05）;但對PDLSCs+PD組牙周膜干細胞Runx2和OCN蛋白表達沒有顯著影響（P >0.05）。見圖2。

3 討論

隨著人口老齡化的到來，以及國民整體健康水平的提高，牙周健康越來越受關(guān)注。牙周炎是影響牙周健康的最常見疾病，會導致牙周結(jié)構(gòu)（如牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)）的破壞引起牙齒活動脫落，是成人牙齒缺少的重要因素[5]。牙周組織修復以及骨再生是這一疾病診治的關(guān)鍵所在。

牙周膜干細胞（PDLSCs）是修復牙周組織最有潛力的成體干細胞[6-7]。其在骨組織修復中起到關(guān)鍵的作用，并且受多種因子所調(diào)控。內(nèi)皮素-1（ET-1）作為日本研究人員從實驗動物豬的主動脈內(nèi)皮細胞中得到的一類血管活性肽[8]，研究表明ET-1可誘導成骨細胞形成新骨。ET-1可以刺激前成骨細胞的增殖分化，并通過膜蛋白-聯(lián)接蛋白促進成骨細胞的分化。另外，ET-1可增加骨鈣素和骨橋蛋白等基因的整合，刺激堿磷酶的釋放和膠原酶的分泌[9]。ET-1不僅參與了牙周炎患者異常牙周組織改建的病理階段，對牙槽骨的吸收也有著不可忽視的效用[10]。在之前的實驗過程中發(fā)現(xiàn)ET-1可以促進了PDLSCs的成骨分化能力，而且MAPKs信號通路參與其中，但調(diào)控機制尚不清楚[4]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作為絲/蘇氨酸蛋白激酶的一種，在體內(nèi)中有著很關(guān)鍵的作用，可以把信號從細胞表面將其傳遞到到核內(nèi)，主要包含細胞外信號調(diào)控激酶1/2 （extracellular signal regulated kinase1/2，ERK-1/2）、c-jun氨基端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）及p38三部分[11-12]，這三種激酶共同介導著細胞的生長、增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程[13]。其中，ERK在細胞增殖和分化中發(fā)揮信號網(wǎng)絡核心的作用。有學者研究發(fā)現(xiàn)ERK信號通路能夠促進Runx2等轉(zhuǎn)錄因子的表達和活性從而促進成骨分化的進程。FGF-2、BMP-2、IGF-1等刺激因子可以通過ERK信號通路調(diào)控細胞的成骨分化過程[14-15]。

在本次實驗中，添加ET-1后，PDLSCs的Runx2和OCN的表達程度和對照組相比明顯提升，加入ET-1和ERK通路抑制劑PD98059后，Runx2和OCN的表達水平和只添加ET-1后發(fā)生了明顯減少的情況，PD98059（ERK通路抑制劑）能夠?qū)T-1誘導的PDLSCs Runx2和OCN表達水平產(chǎn)生抑制的作用，但SP600125（JNK通路抑制劑）和SB203580（p38α通路抑制劑）的抑制作用不顯著。結(jié)果提示ERK信號通路參與了ET-1誘導的PDLSCs骨向分化過程。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)ET-1通過ERK信號通路調(diào)控牙周膜干細胞的成骨分化能力，為牙周炎患者骨組織修復再生提供理論參考。